食品酶學(xué)講稿

參考書(shū)

1酶工程，郭勇主編，高等學(xué)校輕工專(zhuān)業(yè)試用教材，中國(guó)輕工業(yè)出版社;

2酶工程，羅貴民主編，化學(xué)工業(yè)出版社；

3酶與食品加工，［英］G.G.伯奇等主編，鄭壽亭、高培基譯

輕工業(yè)出版社。

4蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)，陶慰孫等編著，高等教育出版社

CH1緒論

CH1—1酶與食品的關(guān)系

1食品酶學(xué)概說(shuō)

食品酶學(xué)這個(gè)概念，是近兒年提出來(lái)的，可以說(shuō)，到目前仍沒(méi)有一個(gè)完

整的定義，就我們選用的教材也是如此，自始至終，沒(méi)有對(duì)食品酶學(xué)下一個(gè)

完整定義；近幾年全國(guó)輕工院校和農(nóng)業(yè)院校的有關(guān)食品專(zhuān)業(yè)，有條件的都開(kāi)

設(shè)了這門(mén)課；可以說(shuō)，不同院校所開(kāi)設(shè)的內(nèi)容不很一致，因?yàn)椴煌娜握n教

師，對(duì)食品酶學(xué)的理解和認(rèn)識(shí)的角度不一定相同；總體課程設(shè)置不同，用于

本課程的學(xué)時(shí)也就不同，不管怎樣，有一點(diǎn)應(yīng)該是一致的，食品酶學(xué)所開(kāi)設(shè)

的內(nèi)容應(yīng)該是與食品有一定關(guān)系的酶學(xué)內(nèi)容，也就是說(shuō)，食品酶學(xué)是酶學(xué)的

一個(gè)分支；在這里我們把食品酶學(xué)定義為：食品酶學(xué)是專(zhuān)門(mén)研究與食品工業(yè)

有關(guān)的酶學(xué)理論及酶工程技術(shù)的學(xué)科。

2酶與食品的關(guān)系

酶與食品的關(guān)系非常重要，這不僅現(xiàn)在酶在食品工業(yè)上顯得重要，很早

以前酶就在食品加工方面起著很重要的作用，在沒(méi)有酶制劑以前，在利用淀

粉原料發(fā)酵時(shí)，來(lái)利用大麥發(fā)芽后轉(zhuǎn)化淀粉成麥芽糖，利用木瓜樹(shù)葉包裹瘦

肉，以促進(jìn)肉的嫩化等;目前酶在食品工業(yè)上的應(yīng)用實(shí)例可以說(shuō)是舉不勝舉。

我們把酶與食品的關(guān)系概括以下兒點(diǎn)：

①酶在食品工業(yè)上應(yīng)用可改善食品工藝

②酶工程技術(shù)將在開(kāi)發(fā)新的食品資源方面起極其重要的作用。

③酶在食品分析中的應(yīng)用將越來(lái)越得到普及。

④酶在食品加工方面應(yīng)用也有其不足之處，因酶是蛋白質(zhì)，具有一定的

免疫原性，有時(shí)引起食品的過(guò)敏反應(yīng)，有些酶蛋白本身對(duì)人體有一定毒性。

如有些蛋白水解酶...........

CH1.2酶的基本概念

1酶是蛋白質(zhì)

酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，這一點(diǎn)是被生物化學(xué)所證明了的，研究酶的化

學(xué)本質(zhì)，可用研究蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行研究；一般情況下，一個(gè)結(jié)構(gòu)完整的酶

包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分，蛋白質(zhì)部分稱(chēng)為輔基酶蛋白，非蛋白質(zhì)部分

稱(chēng)為輔助因子，輔基酶蛋白和輔助因子構(gòu)成一個(gè)全酶。輔助因子的化學(xué)本質(zhì)

因不同的酶而不同，它可以是小分子量的有機(jī)化合物，也可以是無(wú)機(jī)礦物質(zhì)

離子，這兩部分構(gòu)成一個(gè)完整活性酶體系的必不可少部分，缺少任何一部分

都不能表現(xiàn)出有效酶活力。

例如：

2酶具有催化活性

酶是一種生物催化劑，在催化活性上與無(wú)機(jī)催化劑類(lèi)似，酶在催化反應(yīng)

時(shí)，其本身不發(fā)生化學(xué)改變，只是催化反應(yīng)的進(jìn)行，止匕外，酶在催化反應(yīng)時(shí),

僅改變反應(yīng)述度，并不改變反應(yīng)的平衡。酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)機(jī)理是降低反

應(yīng)的活化能。

3酶催化反應(yīng)具有專(zhuān)一性和高效性

酶作為生物催化劑，其催化反應(yīng)的專(zhuān)一性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)無(wú)機(jī)催化劑，根據(jù)酶

的專(zhuān)一化程度，可分為絕對(duì)專(zhuān)一性和相對(duì)專(zhuān)一性。

絕對(duì)專(zhuān)一性是指一種酶只能催化一種底物進(jìn)行一種反應(yīng)，底物的分子結(jié)

構(gòu)、空間構(gòu)型及構(gòu)象的不同都表現(xiàn)出專(zhuān)一性。

2

例如：乳酸脫氫酶(LactatedehydrogenaseEC1.1.1.27)催化丙酮酸生成

L-乳酸而D—乳酸脫氫酶(EC1.1.1.28)卻只能催化催化丙酮酸生成D-乳酸

CH乳酸脫氫酶CH

C=O.；H-C-OH

COOHNADHNAD+COOH

CHD一乳酸脫氫酶CH

C=OvHO-C-H

COOHNADHNAD+COO

相對(duì)專(zhuān)一性是指一種能夠催化一類(lèi)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)進(jìn)行相同類(lèi)型的反

應(yīng)。

例如：胰蛋白酶(TrypsinEC3431.4)催化含有賴(lài)氨酸或精氨酸鍛基的肽

鍵的水解反應(yīng)，凡是具有含賴(lài)氨酸或精氨酸?；０锋I的底物都能被此酶催

化水解。

CH1.3酶的分類(lèi)和命名

1酶的分類(lèi)原則

目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)的酶有3000多種，并且隨著生物化學(xué)研究的深入，認(rèn)識(shí)

酶的種類(lèi)不斷增加，為了準(zhǔn)確地認(rèn)識(shí)某一種酶，避免發(fā)生混亂和誤解，在酶

學(xué)研究和酶工程領(lǐng)域，要求必須對(duì)每一種酶都要有準(zhǔn)確的名稱(chēng)和明確的分

類(lèi)。

一般每一種酶有兩個(gè)名稱(chēng)，一個(gè)是它的習(xí)慣名稱(chēng)，另一個(gè)是其分類(lèi)名稱(chēng),

其分類(lèi)名稱(chēng)一般是根據(jù)它的催化底物來(lái)命名的。

例如：淀粉酶(Diastase),蛋白酶(Protiase),果膠酶(Pectinase),纖維素

酶(Cellulase)等。

以催化底物命名存在的問(wèn)題是，當(dāng)兒種擁有共同底物時(shí)就容易混亂。為

此1955年建立的國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)(InternationalUnionofBiochemistry)酶學(xué)

3

委員會(huì)(EnzymeCommission)□自1956年開(kāi)始進(jìn)行酶的系統(tǒng)命名和分類(lèi)研究,

于1961年該委員會(huì)正式提出了酶的分類(lèi)命名方案。

系統(tǒng)命名：是將底物和催化的反應(yīng)同時(shí)考慮，進(jìn)行命名，如：

a-1,4葡萄糖水解酶；

對(duì)于雙底物的將兩底物用冒號(hào)分開(kāi)：如：ATP:己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶；

對(duì)與可逆反應(yīng)的，一般正反應(yīng)和負(fù)反應(yīng)用同一個(gè)名稱(chēng)，主要考慮催化的

主要方向，或根據(jù)首先證明的催化反應(yīng)來(lái)確定。如乳酸脫氫酶。

此后，分別在1964年、1972年、1978年、1984年進(jìn)行了修訂與補(bǔ)充,

形成了一套目前為普遍接受的酶分類(lèi)體系；系統(tǒng)命名分類(lèi)體系根據(jù)酶催化反

應(yīng)的類(lèi)型將酶分成6大類(lèi)，即：

氧化還原酶.......................(1)

轉(zhuǎn)移酶...........................(2)

水解酶...........................(3)

裂合酶...........................(4)

異構(gòu)酶...........................(5)

合成酶...........................(6)

酶的分類(lèi)編號(hào)原則是采用四碼編號(hào)方法，第一碼代表6大類(lèi)中的哪一

類(lèi)，第二碼代表大類(lèi)中的亞類(lèi)，第三碼表示亞類(lèi)中的小類(lèi)，第四碼表示小類(lèi)

中不同酶的排序號(hào)；四位號(hào)碼之間用圓點(diǎn)(.)分開(kāi)。

例如：水解酶類(lèi)3」是作用于酯鍵的亞類(lèi)3.1.1水解竣酸酯鍵

3.1.2硫醇酯鍵

3.1.7二磷酸單酯

3.2作用于糖基化合物3.2.1水解糖背鍵

3.3作用于酸鍵

3.4作用于肽鍵

2同功酶的概念

籠統(tǒng)地講，同功酶應(yīng)該是指那些具有相同催化功能的不同的酶形式，這

4

些不同形式主要表現(xiàn)為酶蛋白分子的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)和輔酶或

輔基的差異，但是，在酶學(xué)上的概念僅那些具有相同催化功能，而由于遺傳

因素所引起的氨基酸序列不同的酶，換句話(huà)說(shuō)，兩個(gè)同功酶，必須是由兩個(gè)

結(jié)構(gòu)基因編碼的，如果由同一基因編碼，而僅僅是在蛋白合成后的修飾過(guò)程

的差異不能歸同功酶這個(gè)概念。

3酶活力概念及活力測(cè)定

在酶的生產(chǎn)及其應(yīng)用過(guò)程中，衡量酶量的多少的概念有酶的質(zhì)量和酶的

活力，質(zhì)量概念僅僅是一個(gè)相對(duì)量，由于不同來(lái)源的酶制劑，其純度不同，

所以其應(yīng)用效果有很大差異，因此，在酶學(xué)及酶工業(yè)上，用酶活力來(lái)表示酶

量的多少。

酶活力是指在一定條件下，酶所催化的反應(yīng)述度。酶的活力越大，反應(yīng)

述度越高。我們知道，酶催化反應(yīng)述度，用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物

的增加量表示：

dsdp

v=------------=-------

dtdt

既然用酶活力表示酶量，就必須有一個(gè)相應(yīng)的量的單位，即酶的活力單

位；關(guān)于酶活力單位定義在我國(guó)較為混亂，不同的酶采用不同的單位，目前,

對(duì)淀粉糖化酶(Glucoamylases)、果膠酶(Pectinases)、纖維速酶(Cellulases)等,

普遍采用以在最適條件下，每小時(shí)產(chǎn)生lmg產(chǎn)物或轉(zhuǎn)化Img底物的酶量即

為一個(gè)酶活力單位(U)。其他國(guó)家也不盡相同，酶學(xué)委員會(huì)(E.C.)對(duì)酶活

力單位作了統(tǒng)一規(guī)定，酶活力單位定義為：在特定條件下(酶的最適反應(yīng)條

件)，每1min催化1umol底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物(或產(chǎn)生1Umol產(chǎn)物)的酶量

即為一個(gè)酶活力單位(U)；這個(gè)單位又稱(chēng)為國(guó)際單位(IU)。

近些年來(lái)，提出了一個(gè)更大的酶活力單位，即'Katai',一個(gè)'Katai'

單位是在一秒鐘內(nèi)，轉(zhuǎn)化一摩爾底物的酶量。

1Katal=6X107U

酶的活力單位和質(zhì)量單位雖然都是酶量多少的標(biāo)志，兩者之間無(wú)法彼此

對(duì)應(yīng)，為此，人們引用了酶比活力這個(gè)概念。即每mg酶制劑所含的酶活力。

5

酶比活力=酶活力（U）/mg酶制劑

酶活力的測(cè)定方法

酶活力的測(cè)定方法多種多樣，總的要求是快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。

總的說(shuō)，無(wú)論用什么方法，都包括以下幾個(gè)要點(diǎn)

①提供最適底物：由于酶的底物專(zhuān)一性，測(cè)定酶活力時(shí)，提供的底物必

須是最適底物，當(dāng)同時(shí)有幾種底物時(shí)，以Km值最小的為最適底物。

②測(cè)定時(shí)酶量適當(dāng)，酶量太小，形成的產(chǎn)物或轉(zhuǎn)化的底物太少，不利于

測(cè)定，酶量太大，一方面形成的產(chǎn)物太多，超越測(cè)定范圍；此外，當(dāng)酶量太

大時(shí)，底物不能使酶最大飽和，測(cè)定的反應(yīng)述度不是最大反應(yīng)述度。

③確定反應(yīng)時(shí)間，既然；測(cè)定酶活力是測(cè)得最大反應(yīng)述度，反應(yīng)時(shí)間太

長(zhǎng)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，底物不斷減少，到反應(yīng)后期，反應(yīng)述度下降，測(cè)定出現(xiàn)

誤差；反應(yīng)時(shí)間太短，在操作過(guò)程中，人為的時(shí)間誤差很大，也不利于準(zhǔn)確

測(cè)定。

④反應(yīng)條件應(yīng)是最適反應(yīng)條件，主要包括反應(yīng)溫度、pH值和基質(zhì)的離

子環(huán)境。

6

CH2酶學(xué)概論

CH1-1酶的結(jié)構(gòu)和功能

酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，酶包括單一酶和結(jié)合酶兩類(lèi)，單一酶的催化活

性?xún)H由其酶蛋白部分完成，而結(jié)合酶的催化活性，除蛋白部分外，還需要金

屬離子或其它小分子有機(jī)化合物作為酶的輔助因子。結(jié)合酶又稱(chēng)為全酶，其

由酶蛋白和輔助因子兩部分組成。無(wú)論是單一酶還是結(jié)合酶，其蛋白質(zhì)部分

的結(jié)構(gòu)構(gòu)成其功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1.酶催化功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

1.1酶的活性中心

酶是大分子生物活性物質(zhì)，一般來(lái)講，分子量至少都在1O4以上，由

數(shù)百個(gè)或更多的氨基酸殘基組成?，F(xiàn)已證明，在酶蛋白上，只有少數(shù)氨基酸

殘基和酶催化活力直接有關(guān)。這些氨基酸殘基一般不集中在肽鏈的某一區(qū)

域，也不相互毗鄰，往往分散在相距較遠(yuǎn)的氨基酸序列中，甚至有的分布在

不同的肽鏈中。顯然，這些氨基酸呈分散狀態(tài)時(shí)，不能發(fā)揮其共同的催化活

性，這些氨基酸是通過(guò)酶蛋白的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)使得其在空間上彼此集中，

構(gòu)成一個(gè)特定的與酶活性表達(dá)有關(guān)區(qū)域，這個(gè)特定區(qū)域即酶的活性中心

(activecenter),換句話(huà)說(shuō)，酶的活性中心是酶分子上的與底物結(jié)合并催化反

應(yīng)的特定基團(tuán)或特定區(qū)域。

酶活性中心包括兩部分，其一是底物結(jié)合部位，其二是催化部位；底物

結(jié)合部位是酶與底物特異性結(jié)合的部位，又叫專(zhuān)一性決定部位。催化部位直

接參與催化反應(yīng)，底物的敏感鍵在此部位被催化形成相應(yīng)的產(chǎn)物。底物結(jié)合

部位和催化部位兩者不能絕對(duì)分開(kāi)，任何單一部位都不能孤立地發(fā)揮作用，

有時(shí)兩者合二為一。

例如:

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1.2酶催化的鄰近和定向效應(yīng)

鄰近效應(yīng)是指A和B兩個(gè)底物分子結(jié)合在酶分子的結(jié)合部位上，兩分

子的反應(yīng)基團(tuán)相互靠近，從而降低了兩分子進(jìn)入過(guò)渡態(tài)所需要的能量，或說(shuō)

增加了兩分子反應(yīng)基團(tuán)的發(fā)生反應(yīng)的空間機(jī)率。

A、B兩個(gè)分子進(jìn)入過(guò)渡太，兩分子的反應(yīng)基團(tuán)的需要按一定的方向重

疊或交叉，這一方向稍有偏離，反應(yīng)就難以進(jìn)行或增加很大能量才能進(jìn)行，

這種酶活性部位賦予底物的這一方向性即定向效應(yīng)。

1.3酶的別構(gòu)部位(allostericsite)

酶分子表現(xiàn)其活性是以完整的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，某些酶除其活性部位外，

還有一個(gè)別構(gòu)部位影響酶的活性，這些酶又稱(chēng)為別構(gòu)酶或變構(gòu)酶。多為代謝

代謝調(diào)節(jié)酶，由別構(gòu)部位的變構(gòu)改變酶的活性，別構(gòu)部位的變構(gòu)也是通過(guò)與

一個(gè)配體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但其與酶的活性部位不同，別構(gòu)部位結(jié)合的配體不

是底物，而是一個(gè)調(diào)節(jié)酶活性的效應(yīng)物。

2.酶催化專(zhuān)一性的經(jīng)典學(xué)說(shuō)

2.1鎖鑰學(xué)說(shuō)(lockandkeytheory)

1894年，E.Fisher提出酶與底物作用的鎖鑰學(xué)說(shuō)，以解釋酶與底物之間

的專(zhuān)一性問(wèn)題，其基本含義是：酶與底物分子或底物分子的一部分之間，在

結(jié)構(gòu)上有嚴(yán)格的互補(bǔ)對(duì)應(yīng)關(guān)系，當(dāng)?shù)孜锱c酶結(jié)合時(shí)就象鑰匙和鎖那樣契合對(duì)

應(yīng)。

鎖鑰學(xué)說(shuō)對(duì)于了解酶的立體專(zhuān)一性及酶與簡(jiǎn)單底物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)理論

有一定的邦助；但鎖鑰學(xué)說(shuō)，認(rèn)為酶的活性部位就象鎖那樣有著固定的結(jié)構(gòu),

并且是一個(gè)不變的剛性結(jié)構(gòu)，作為鑰匙的底物不能有任何結(jié)構(gòu)上的改變，盡

管鎖鑰學(xué)說(shuō)有其合理的內(nèi)核，但有許多實(shí)驗(yàn)事實(shí)該理論不能解釋。

8

2.2誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)(induced-fithypothesis)

1958年，Koshland提出了誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)，其主要內(nèi)涵是：當(dāng)酶與底物

分子接近時(shí)，酶蛋白受底物分子的誘導(dǎo)，其構(gòu)象發(fā)生有利于與底物分子結(jié)合

或催化的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)契合，以發(fā)揮酶的催化功能。

本學(xué)說(shuō)繼承了鎖鑰學(xué)說(shuō)酶與底物特異結(jié)合的合理內(nèi)核，同時(shí)拼棄了其機(jī)

械不變的剛性理論。誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)，不僅能解釋鎖鑰學(xué)說(shuō)不能解釋的實(shí)驗(yàn)事

實(shí)，而且近年來(lái)運(yùn)用物理化學(xué)方法，如X—射線衍射分析、旋光色散分析、

圓二色性分析、核磁共振、差示光譜等現(xiàn)代研究方法，確實(shí)證實(shí)了酶與底物

結(jié)合時(shí)，酶的構(gòu)象發(fā)生改變。

CH1.2酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)

酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)所研究的主要內(nèi)容包括酶濃度、底物濃度、溫度、pH、

離子強(qiáng)度、激活劑和抑制劑等諸因素對(duì)酶催化反應(yīng)的影響。

由于酶分子是一個(gè)大分子生物催化劑，催化反應(yīng)的體系非常復(fù)雜，因此

酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是一個(gè)復(fù)雜的研究課題，在這里我們僅討論酶催化反應(yīng)動(dòng)

力學(xué)的兒個(gè)基本問(wèn)題。

1.酶催化反應(yīng)的初述度

酶催化反應(yīng)的述度是用單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的形成或底物的減少量來(lái)表示

的，對(duì)于一個(gè)酶催化反應(yīng)S---------P

d[s]d[p]

V=----------=----------

dtdt

9

圖1酶催化反應(yīng)述度圖2酶催化反應(yīng)的初述度

可以看出，反應(yīng)述度隨反應(yīng)的進(jìn)行，而逐漸降低，因此研究酶催化反應(yīng)

動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)述度的概念必需是一個(gè)特定時(shí)間下的述度，通常研究酶催化反

應(yīng)動(dòng)力學(xué)采用的反應(yīng)述度是引用初述度這個(gè)概念，初述度即反應(yīng)時(shí)間為零時(shí)

的極限述度，因?yàn)橹挥谐跏龆仁窃诶硐霔l件下進(jìn)行的反應(yīng)述度，干擾反應(yīng)述

度的因素最少。圖中曲線的斜率即為初述度

2.底物濃度對(duì)反應(yīng)述度的影響

以單底物-單產(chǎn)物的酶催化反應(yīng)模型為例，當(dāng)酶量固定不變時(shí)，底物濃

度對(duì)反應(yīng)述度的影響見(jiàn)圖3

2.1Michaelis-Menten迅述平衡學(xué)說(shuō)及Henri-Michaelis-Mentwen方程

單底物酶促反應(yīng)模型：

klkpk3

E+S------------ES------------E+P

-kl

圖3底物濃度對(duì)反應(yīng)述度

迅述平衡學(xué)說(shuō)對(duì)上述反應(yīng)模型有兩點(diǎn)假定：①酶與底物結(jié)合形成酶底物

復(fù)合物的述度很快。②整個(gè)反應(yīng)述度取決于酶底物復(fù)合物釋放出游離酶和形

成產(chǎn)物的反應(yīng)述度，因此反應(yīng)述度

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v=kp[ES]...........................................................(1)

Ks=[E][S]/[ES](Ks是ES的分解常數(shù))....(2)

[ES]=[E][S]/Ks...................................................(3)

如果我們?cè)O(shè)反應(yīng)體系中酶的總濃度為口,當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡以后，酶分子以

下列兩種形式存在：[EO]=[E]+LES]...............................(4)

將3式分別和1式4式加以整理便得：

v=Kp[E][S]/Ks...........(5)

[EO]=[EJ+[E][S]/Ks...................................(6)

將5式除以6式得：

Kp[E][S]/KsKp[S]/Ks

v/[EO]=.......................................(7)

[E]+[E][S]/Ks1+[S]/Ks

.將兩邊都乘以1/Kp

[S]/Ks

v/Kp[EO]=.(8)

1+[S]/Ks

,/v=Kp[ES]只有當(dāng)[EO]全部轉(zhuǎn)變成[ES]時(shí)，反應(yīng)才能達(dá)到最大反應(yīng)

述度。Vm=Kp[E0].................................(9)

將9式和8式整理得：

[S]/Ks[S]

v/Vm=----------------=-------------------.......(10)

1+[S]/KsKs+[S]

Vm[S]

v=..........................(11)

Ks+[SJ

11

這就是Hemri-Michaelis-Menten方程。也就是我們所說(shuō)的米氏方程。

我們總結(jié)一下，利用迅述平衡學(xué)說(shuō)進(jìn)行米氏方程的推導(dǎo)有以下三點(diǎn)基本

假設(shè)：

①在反應(yīng)模型中，不考慮ES-E+P的逆反應(yīng)，然而，對(duì)于大多數(shù)酶促

反應(yīng)來(lái)說(shuō)，反應(yīng)是可逆的，要忽略這一逆反應(yīng)，只有在反應(yīng)的起始，產(chǎn)物P

f0時(shí)才成立。

②[S]大大高于[E]值，在反應(yīng)過(guò)程中，底物的消耗可忽略不計(jì)。

③ES解離成E+S的述度顯著快于ES形成E+P的述度，即ES-E+P的

反應(yīng)不影響E+S---------ES的平衡。

2.2恒態(tài)學(xué)說(shuō)及對(duì)米氏方程的修正

事實(shí)上迅述平衡學(xué)說(shuō)對(duì)很多反應(yīng)不太適宜，為此，1925年，Briggs和

Handane對(duì)米氏方程進(jìn)行了修正,提出了恒態(tài)學(xué)說(shuō)。其基本內(nèi)涵是：在初述

度測(cè)定過(guò)程中，底物濃度隨反應(yīng)時(shí)間而降低，產(chǎn)物相應(yīng)增高；而中間復(fù)合物

ES可在相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)保持濃度的恒定狀態(tài)。Briggs和Handane對(duì)米氏方

程的修正，保留了迅述平衡學(xué)說(shuō)的前兩點(diǎn)假設(shè)，因此，反應(yīng)模型仍為：

klkp

E+S-------------ES-------------E+P

-kl

底物的消耗述度為K1[E][S],底物的消耗用于ES的形成，ES已經(jīng)形成,

就會(huì)按K1[ES]的述度解離成E+S,同時(shí)ES按Kp[ES]的述度形成E+P。

v=Kp[ES]..........................................................................(1)

[EO]=[E]+[ES]................................................................(2)

v/[EOJ=Kp[ES]/{[E]+[ES]}.......................................(3)

v/Vm=[ES]/{[E]+[ES]}...............................................(4)

恒態(tài)學(xué)說(shuō)認(rèn)為：

Kl[E][S]=K-l[ES]+Kp[ES]=(K-l+Kp)[ES]……(5)

[ES]=K1[E][S]/(K-1+Kp)............................................(6)

定義:(K-1+Kp)/Kl=Km................................................(7)

[ES]=[S][E]/Km.....................................................(8)

12

將(8)式代入(4)式得:

[S][E]/Km

v/Vm=------------------------=[S]/(Km+[S])....(9)

[E]+[S][E]/Km

Vm[S]

v=......................................................................(10)

Km+[S]

(10)式即為修正的單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，為了紀(jì)念

Michaelis-Menten創(chuàng)造性工作，這個(gè)方程也稱(chēng)為Michaelis-Menten方程，簡(jiǎn)

稱(chēng)米氏方程。式中Vm為最大反應(yīng)述度，Km為米氏常數(shù)。

2.3關(guān)于米氏方程意義的討論：

①反應(yīng)述度v是底物濃度[S]的函數(shù)，其兒何意義是一條雙曲線，當(dāng)[S]

遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Km{[S]》Km}時(shí)，V-Vm；在測(cè)定酶活力時(shí)，必需提供足夠大的

底物濃度；反之,當(dāng)[S]《Km時(shí)，V-Vm[S]/Km,因?yàn)樵谝欢l件下，對(duì)于

一個(gè)酶來(lái)說(shuō)，Vm/Km是一個(gè)常數(shù)，所以，反應(yīng)述度V與底物濃度⑶成宜線

關(guān)系，在酶法分析中，利用酶測(cè)定底物濃度時(shí);應(yīng)提供足夠大的酶濃度，使

得產(chǎn)物與底物濃度成直線關(guān)系，以根據(jù)產(chǎn)物的形成來(lái)測(cè)定底物濃度。

②Km是酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，其等于當(dāng)達(dá)到最大述度一半時(shí)的底物

濃度。Km值是酶的一個(gè)特征性常數(shù)，它不受酶量，酶的純度的影響，當(dāng)pH、

溫度、介質(zhì)的離子強(qiáng)度等不變時(shí),Km值不變。它是酸介底物親和力的標(biāo)志,

Km值越大，標(biāo)志要使反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)'必須提供的底物

濃度越大，即酶與底物的親和力越小；反之亦反。

③因?yàn)閂m=Kp[E0],所以，當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼髸r(shí)，最大反應(yīng)述度Vm

與酶量成正相關(guān)，因此Vm是隨酶量而變化的常數(shù)。催化反應(yīng)的Vm應(yīng)換算

成酶的催化常數(shù)Kcat,Kcat是每摩爾酶催化每摩爾底物轉(zhuǎn)化或產(chǎn)生每摩爾

產(chǎn)物所需的時(shí)間。

3酶濃度對(duì)酶活力的影響

根據(jù)米氏方程V=Vm[SJ/{Km+[S]}

當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼髸r(shí)，V-Vm=Kp[E0]

因此，酶促反應(yīng)述度與酶濃度在一定的底物濃度范圍內(nèi)與酶濃度成正

13

比。

4pH對(duì)反應(yīng)述度的影響

大部分酶的活性受pH的影響，在一定的pH條件下，酶促反應(yīng)具有最

大反應(yīng)述度，當(dāng)pH高于或低于該pH值時(shí)，反應(yīng)述度都降低；此pH范圍即

為最適pH。用酶活力對(duì)pH作圖，便得到一條鐘形曲線。

圖pH對(duì)酶活力的影響

pH對(duì)酶活力的影響主要表現(xiàn)在以下兒個(gè)方面：

①pH的改變影響酶的空間構(gòu)象，從而引起酶活力的改變。

②pH影響酶活性中心催化基團(tuán)的解離，影響酶與底物的親合力或催化

活性。

③pH影響底物的解離狀態(tài)，改變底物的可給性。

5溫度對(duì)酶促反應(yīng)述度的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，溫度對(duì)酶活力的影響，類(lèi)似于pH對(duì)酶活力的影響,

以酶活力對(duì)溫度作圖，便得到一條鐘形曲線。

圖溫度對(duì)酶活力的影響

溫度對(duì)酶活力的影響，主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面溫度的改變影響著

酶的穩(wěn)定性，在低溫條件下，主要表現(xiàn)為可逆行失活，隨溫度的恢復(fù)酶活力

也得到恢復(fù)；在高溫條件下，表現(xiàn)為不可逆行失活。另一方面，溫度直接影

14

響酶促反應(yīng)的進(jìn)行，根據(jù)Arrhenius方程：k=Ae-Ea/RT可以看出，述度常

數(shù)k與絕對(duì)溫度T成正比。

CH3酶工程技術(shù)概論

酶工程技術(shù)作為生物工程技術(shù)的四大領(lǐng)域之一，目前可以說(shuō)，在生產(chǎn)上

發(fā)揮著巨大作用的當(dāng)為發(fā)酵工程和酶工程技術(shù)。概括地講，酶的生產(chǎn)和應(yīng)用

的技術(shù)過(guò)程即稱(chēng)為酶工程。酶工程技術(shù)主要包括內(nèi)容有：酶的發(fā)酵生產(chǎn)、酶

的分離純化、酶分子的修飾、酶的固定化和酶反應(yīng)器、以及酶的應(yīng)用工程技

術(shù)。

酶工程的主要任務(wù)是：通過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)人工操作而獲得大量所需要的

酶，并通過(guò)各種方法使酶發(fā)揮最大的催化功能。

CH3-1酶的發(fā)酵生產(chǎn)

所有生物體在一定條件下都能產(chǎn)生多種酶，酶在生物體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)程，

稱(chēng)為酶的生物合成。目前工業(yè)酶制劑的主要來(lái)源主要包括：通過(guò)微生物發(fā)酵

生產(chǎn)和從動(dòng)植物細(xì)胞中提取兩個(gè)途徑。

以前\酶的發(fā)酵生產(chǎn)，主要是利用微生物發(fā)酵來(lái)完成的；目前?,酶的發(fā)

酵生產(chǎn)已不限于微生物，利用動(dòng)植物細(xì)胞的發(fā)酵已成為可能，無(wú)論是微生物

還是動(dòng)植物細(xì)胞，用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)，必需具備以下幾個(gè)條件：

①必需具有優(yōu)良的產(chǎn)酶性狀，產(chǎn)酶水平高到使生產(chǎn)成本降低，能滿(mǎn)足工

業(yè)化應(yīng)用要求，否則就不能用于生產(chǎn)。

②細(xì)胞易于培養(yǎng)和生長(zhǎng)發(fā)育，也就是細(xì)胞必需具有快述生長(zhǎng)繁殖的特

點(diǎn)，并且對(duì)發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)要求不高。

15

③細(xì)胞的產(chǎn)酶性能必需穩(wěn)定，只有細(xì)胞具有穩(wěn)定的生產(chǎn)性能，才能夠進(jìn)

行穩(wěn)定的發(fā)酵生產(chǎn)。

④最好選用產(chǎn)胞外酶的細(xì)胞，并且其它副產(chǎn)物少，有利于酶制劑的提取

和提純。⑤細(xì)胞必需無(wú)毒無(wú)害，尤其是用于食品工業(yè)的酶制劑，必需保證

無(wú)毒無(wú)害。這是衡量細(xì)胞能否用于食品工業(yè)酶制劑生產(chǎn)的主要指標(biāo)。

盡管生物技術(shù)已取得突破性進(jìn)展，目前酶制劑生產(chǎn)還主要以微生物為

主。我們這里僅介紹利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的有關(guān)問(wèn)題。

1發(fā)酵原料和輔助性原料

1.1碳氮源

利用微生物生產(chǎn)酶制劑的主要原料是碳源和氮源，此外還有無(wú)機(jī)鹽、生

長(zhǎng)因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑。這些發(fā)酵原料與微生物的培養(yǎng)基原料類(lèi)似。但是，考

慮發(fā)酵培養(yǎng)基的原料時(shí)，除有利于發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)繁殖外，更重要的考慮

因素是：首先所有原料成分，應(yīng)該有利于酶的產(chǎn)生或不影響酶的產(chǎn)生；其次

要考慮原料成本，我們生產(chǎn)商品酶制劑，生產(chǎn)成本的高低，直接影響著企業(yè)

的經(jīng)濟(jì)效益。簽于上述考慮，目前所利用的有機(jī)碳源，主要是來(lái)源于農(nóng)副產(chǎn)

品原料，用的最多的有甘薯干、玉米、效皮、米糠等等；有機(jī)氮源主要有油

料作物的籽實(shí)在榨油后的副產(chǎn)品，如豆餅、花生餅、菜籽餅、棉籽餅等，此

外無(wú)機(jī)氮源也比較常用，如硫酸鐵、氯化錢(qián)、硝酸鏤、磷酸氫二鏤、尿素等。

1.2產(chǎn)酶促進(jìn)劑

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加某些少量成分，能顯著提高酶的產(chǎn)量，這類(lèi)添加成

分即為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。常用的產(chǎn)酶促進(jìn)劑是產(chǎn)酶的誘導(dǎo)物或表面活性劑，誘導(dǎo)

物主要是對(duì)那些誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生誘一定的誘導(dǎo)作用，能顯著提高酶的產(chǎn)量；而

表面活性劑則是通過(guò)改變細(xì)胞的通透性，促進(jìn)酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。

下表是表面活性劑吐溫80(0o1%)對(duì)多種酶產(chǎn)生的影響：

酶來(lái)源酶產(chǎn)量增加倍數(shù)

纖維素酶多種霉菌20

轉(zhuǎn)化酶多種霉菌16

3-1,3葡聚糖酶多種霉菌10

16

B—葡萄糖甘酶多種霉菌8

木聚糖酶多種霉菌4

淀粉酶多種霉菌4

酯酶多種霉菌6

2發(fā)酵方法

利用微生物生產(chǎn)酶制劑的發(fā)酵方法分固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法，對(duì)于酶

制劑生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，兩種方法各有側(cè)重，各有特點(diǎn)。

2.1固態(tài)發(fā)酵法

固態(tài)發(fā)酵法又稱(chēng)為款曲培養(yǎng)法，該法是利用裁皮或米糠為主要原料?，添

加其它輔料，制成固體培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵的一種方法。該方法的特點(diǎn)是：①

本法對(duì)設(shè)備條件要求簡(jiǎn)單，適合投入力量不足的鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)生產(chǎn)；②此法利用

固體培養(yǎng)基，由于秋皮、米糠等的通氣性好，尤其是對(duì)于好氧性微生物的發(fā)

酵，通氣對(duì)產(chǎn)酶的影響很大；③固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)酶效率高，一般情況下，每克

發(fā)酵基質(zhì)的產(chǎn)酶量是液態(tài)發(fā)酵每毫升發(fā)酵液的10倍；④但是，液態(tài)發(fā)酵有

其局限性，首先，液態(tài)發(fā)酵需要繁重的勞動(dòng)，需更多的人力投入；其次，固

態(tài)發(fā)酵不利于自動(dòng)化控制。

根據(jù)固態(tài)發(fā)酵所使用的設(shè)備和通氣方法不同，常用的發(fā)酵方法有以下兒

種：

①淺盤(pán)發(fā)酵法：此法是將固體培養(yǎng)基平鋪在淺盤(pán)內(nèi)，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)

和產(chǎn)酶，一般都是用木制的淺盤(pán)或竹編的匾框，鋪培養(yǎng)基約3?5厘米厚，

控制溫度和濕度進(jìn)行發(fā)酵。

②轉(zhuǎn)桶發(fā)酵法：此法是將固態(tài)培養(yǎng)基接種后，在可旋轉(zhuǎn)的桶內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵,

發(fā)酵桶在發(fā)酵過(guò)程中，慢慢地進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，以有利于通氣。

③厚層通氣發(fā)酵法：又叫深池發(fā)酵法，此法是在淺發(fā)酵法的基礎(chǔ)上發(fā)展

起來(lái)的，在發(fā)酵池的底部，設(shè)計(jì)成多孔假底，在發(fā)酵池內(nèi)鋪20-30厘米厚的

培養(yǎng)基，（近年來(lái)，在國(guó)外已發(fā)展到，培養(yǎng)基的厚度達(dá)到1?2米厚），當(dāng)

接種的微生物開(kāi)始生長(zhǎng)，曲溫開(kāi)始升高時(shí)，在發(fā)酵池的假底下通入具有一定

濕度和溫度的空氣，本法與前兩種方法相比，投資稍大，但其生產(chǎn)效率遠(yuǎn)高

17

于前兩種方法。

2.2液態(tài)發(fā)酵法

液態(tài)發(fā)酵方法，是利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的，其特

點(diǎn)是：①液態(tài)發(fā)酵的自動(dòng)化控制程度高，節(jié)省人力投入；②液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的

酶制劑易提取制備。③液態(tài)發(fā)酵適合于大規(guī)模生產(chǎn)；④液態(tài)發(fā)酵的投資要求

高，要求生產(chǎn)的技術(shù)條件高。

液態(tài)發(fā)酵方法在很早是利用液體表面發(fā)酵法，此法是利用發(fā)酵盤(pán)或發(fā)酵

箱，裝淺層發(fā)酵液，進(jìn)行靜置發(fā)酵，目的是讓發(fā)酵液與空氣有充分的接觸面

積，但是，此法，最大弊病是不利于防污染，發(fā)酵周期長(zhǎng)；目前此法已趨于

淘汰。

目前液態(tài)發(fā)酵普遍采用的是'液態(tài)深層通氣發(fā)酵法'，此法所需要的主

要設(shè)備是發(fā)酵罐和密閉通氣裝置，目前我國(guó)在酶制劑生產(chǎn)中，采用的發(fā)酵罐

最大的是50噸罐，小的有10噸罐，發(fā)酵培養(yǎng)基配制、滅菌冷卻等都是在一

個(gè)罐中完成，這對(duì)于防污染非常有利，目前發(fā)達(dá)國(guó)家，液體發(fā)酵已開(kāi)始進(jìn)行

連續(xù)發(fā)酵，而我國(guó)現(xiàn)仍沿用著分批發(fā)酵法，由于連續(xù)發(fā)酵法的生產(chǎn)效率很高,

但對(duì)于防污染，防噬菌體的侵染問(wèn)題難度較大。

3發(fā)酵產(chǎn)酶的影響因素

酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)，除菌種的生產(chǎn)性狀和發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)量有顯著性影

響外，發(fā)酵工藝條件對(duì)酶的產(chǎn)量也有很大的影響，主要有發(fā)酵溫度、基質(zhì)的

pH值，通氣量等發(fā)酵條件。

3.1發(fā)酵溫度：

對(duì)于微生物來(lái)講，其生長(zhǎng)繁殖需要一定的溫度，酶蛋白的合成也需要一

定的溫度，一般情況下，微生物的最適生長(zhǎng)溫度與其最適產(chǎn)酶溫度稍有差異,

所以，在發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)，發(fā)酵工藝溫度控制，應(yīng)在微生物生長(zhǎng)時(shí)期和產(chǎn)酶時(shí)期

作相應(yīng)的調(diào)整，以提供相應(yīng)的最適溫度；在剛接種的初期，微生物尚未大量

生長(zhǎng)起來(lái)，這一階段，主要是通過(guò)供熱和保溫來(lái)保持發(fā)酵液溫度的恒定大量

微生物生長(zhǎng)起來(lái)以后，由于微生物細(xì)胞的代謝旺盛，這時(shí)，發(fā)酵液的熱量來(lái)

源主要有細(xì)胞的代謝熱、通氣帶入的熱量和發(fā)酵液機(jī)械攪拌產(chǎn)生的機(jī)械熱。

這些熱能足以使發(fā)酵液的溫度上升，所以，這個(gè)時(shí)期控制發(fā)酵液的溫度主要

是進(jìn)行降溫冷卻。

18

3.2基質(zhì)的pH值：

酶制劑生產(chǎn)中，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值直接影響著酶的產(chǎn)量

和質(zhì)量。在發(fā)酵過(guò)程中，微生物的代謝活動(dòng)也與基質(zhì)的pH值直接發(fā)生關(guān)系,

一方面代謝活動(dòng)受pH的影響，同時(shí)由于代謝過(guò)程中，不斷有代謝產(chǎn)物分泌

到周?chē)h(huán)境而改變基質(zhì)的pH值，所以在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液的pH值會(huì)發(fā)

生不斷改變，對(duì)于微生物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，其產(chǎn)酶的最適pH范圍是固定的，發(fā)酵

液pH的改變勢(shì)必要影響微生物的產(chǎn)酶效率。

發(fā)酵液的pH改變還受到其它條件的影響，如果發(fā)酵液中以碳源物質(zhì)為

主，在發(fā)酵過(guò)程中，pH的變化趨勢(shì)是隨著發(fā)酵進(jìn)行而下降；反之，如果氮

源物質(zhì)占很大比例，則pH趨向上升的變化。另外通氣量的大小也影響著pH

的變化，當(dāng)量大時(shí)，細(xì)胞的有氧代謝占主導(dǎo)地位，糖和脂肪的氧化進(jìn)行較為

徹底，其最終產(chǎn)物是二氧化碳和水，pH的變化就相對(duì)慢些，反之，當(dāng)通氣

量不足時(shí)，碳源物質(zhì)的氧化不徹底，大量有機(jī)酸中間產(chǎn)物積累，pH降低較

快。

在酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)中，必須采取方法控制發(fā)酵液pH的變化，使其保持

恒定不變；控制pH變化的方法通常是通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基起始pH值，添加一

定的

pH緩沖劑，調(diào)節(jié)基質(zhì)中的碳氮比，使在發(fā)酵過(guò)程中，基質(zhì)的pH保持在一

定范圍，必要時(shí)，還可以添加酸堿調(diào)節(jié)劑來(lái)恒定pH值。

目前，在液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)中，都是自動(dòng)調(diào)節(jié)控制的，通過(guò)安裝在發(fā)酵罐

里的pH敏感電極來(lái)進(jìn)行自動(dòng)化調(diào)節(jié)。

3.3通氣量

對(duì)于好氧性微生物，在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，需要不斷地從周?chē)h(huán)境吸收

氧，由于在液態(tài)發(fā)酵時(shí)，微生物細(xì)胞混懸于液態(tài)基質(zhì)中，細(xì)胞不能直接吸收

空氣中的氧，必須通過(guò)氧分子溶解在發(fā)酵液中，細(xì)胞吸收基質(zhì)中的溶氧，一

般情況下，細(xì)胞吸收氧氣，是通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散的吸收方式來(lái)吸收的，所以，要

保證細(xì)胞有充足的氧氣供應(yīng)，發(fā)酵液中必須有一定濃度的溶氧。溶在發(fā)酵液

中的氧氣不是固定不變的，一方面它不斷被微生物細(xì)胞消耗，另一方面，它

還不斷地從空氣中吸收，如果說(shuō)發(fā)酵液中的溶氧恒定不變的話(huà)，那僅是一個(gè)

動(dòng)態(tài)平衡。不同微生物，對(duì)氧的需要量不同；我們把單位時(shí)間內(nèi)發(fā)酵液吸收

空氣中的氧氣量叫溶氧述率，對(duì)于一個(gè)特定菌種來(lái)講，對(duì)發(fā)酵液的溶氧述率

有一個(gè)特定的要求，溶氧述率過(guò)高或不足都不利于酶的產(chǎn)生。如用來(lái)生產(chǎn)淀

19

粉糖化酶的黑曲酶，在發(fā)酵的早期，大量菌體生長(zhǎng)，適宜的溶氧述率為

50-55mmoL「.h”,到大量酶蛋白產(chǎn)生時(shí)，其需要適宜的溶氧述率為20

1

mmol.r'.h-o

控制發(fā)酵液溶氧述率的方法主要是通過(guò)直接給發(fā)酵液通氣，同時(shí)進(jìn)行攪

拌，攪拌的作用是促進(jìn)氧氣的傳遞，增加溶氧量。

3.4泡沫和消泡劑

在液態(tài)發(fā)酵時(shí)，由于通氣和攪拌，在發(fā)酵液表面形成大量泡沫，并且形

成的泡沫持久性很強(qiáng)，在發(fā)酵液表面的泡沫層阻礙了發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CO2

的排除以及發(fā)酵液對(duì)02的吸收，從而將嚴(yán)重影響酶的產(chǎn)生。

在發(fā)酵過(guò)程中，必須采取措施消除泡沫，消泡的方法主要有機(jī)械法：在

發(fā)酵罐的攪拌軸的上端（在發(fā)酵液面以上）裝攪拌槳，在發(fā)酵攪拌的同時(shí)，

消泡攪拌槳打擊泡沫，起到消泡的作用。一般情況下，僅僅靠機(jī)械消泡是不

夠的，還必須配合消泡劑添才能起到充分消泡作用，添加的消泡劑必須具備

以下條件：①表面張力較低，并且難溶于水或不溶于水；②必須不對(duì)發(fā)酵微

生物的正常代謝產(chǎn)生阻礙作用；③無(wú)毒無(wú)害物質(zhì)，尤其是生產(chǎn)食品工業(yè)酶制

劑，此項(xiàng)要求更為嚴(yán)格；④價(jià)格便宜取材方便。

目前已認(rèn)識(shí)到能供消泡劑使用的主要有：礦物油類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、脂肪酸

酯類(lèi)、酰胺類(lèi)、酸類(lèi)、磷酸酯類(lèi)聚硅氧烷等，我國(guó)酶制劑生產(chǎn)常用的是聚氧

丙烯甘油酸、泡敵（聚環(huán)氧丙烷環(huán)氧乙烷甘油酸），前者是非電離性高分子

表面活性劑，外觀為淡黃色油狀物，難溶于水，易溶于乙醇和苯等有機(jī)溶劑,

消泡能力強(qiáng)，用量少，并且性能穩(wěn)定，耐高壓滅菌，在酶制劑發(fā)酵應(yīng)用中，

無(wú)不良影響，對(duì)人體有無(wú)慢性中毒問(wèn)題尚未確定。

3.4濕度

在固態(tài)發(fā)酵時(shí);培養(yǎng)基的濕度（即水分含量）和發(fā)酵室空氣中的相對(duì)濕

度對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酶有很大關(guān)系，不同的菌種，對(duì)濕度的要求不同,

在發(fā)酵過(guò)程中，不同的發(fā)酵階段也不完全一致，一般在菌體大量生長(zhǎng)階段要

求濕度低些，而在大量產(chǎn)酶階段要求濕度高些。

CH2-2酶制劑的制備和精制

由于發(fā)酵微生物的種類(lèi)不同，有的是以胞內(nèi)酶為主，有的以胞外酶為主,

無(wú)論哪一種，最終得把它們提取出來(lái)，并使其達(dá)到一定的純度，這就是酶制

20

劑的制備和精制的任務(wù)。目前我國(guó)生產(chǎn)的工業(yè)酶制劑，普遍純度較低，而目

前在世界上占統(tǒng)治地位的丹麥NOVO公司生產(chǎn)的酶制劑的純度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于我

國(guó)的產(chǎn)品。如果膠酶(Pectinases),NOVO公司生產(chǎn)的酶制劑的比酶活力較我

國(guó)最好的產(chǎn)品高5—10倍，隨然酶制劑的價(jià)格較高，但其在生產(chǎn)上應(yīng)用成本

遠(yuǎn)低于我國(guó)的產(chǎn)品。

1酶制劑的工業(yè)提取方法

酶制劑的工業(yè)提取法是指工業(yè)上大批量提取制備方法，工業(yè)上用的酶制

劑，一般用量較大，但對(duì)酶的純度要求不高，盡管如此，工業(yè)酶制劑也要求

酶的純度在生產(chǎn)允許的條件下，盡可能地提高酶的純度。下面我們介紹一些

酶制劑的提取制備方法：

1.1細(xì)胞破碎方法

對(duì)于胞內(nèi)酶的提取與制備，首先要把細(xì)胞破碎，使局限在細(xì)胞內(nèi)的酶蛋

白游離出來(lái)，常用的破碎方法有以下兒種：

1.1.1機(jī)械破碎法

機(jī)械破碎法是指通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力來(lái)破碎細(xì)胞，主要包括以下

幾種：

①機(jī)械搗碎法：利用搗碎機(jī)的高述旋轉(zhuǎn)葉片來(lái)打碎細(xì)胞，一般要求旋轉(zhuǎn)

述度達(dá)到10000轉(zhuǎn)/分，才能達(dá)到破碎效果。此法適合于規(guī)模生產(chǎn)。

②研磨法：此法是通過(guò)研磨來(lái)實(shí)現(xiàn)破碎細(xì)胞的目的，其在大規(guī)模工業(yè)化

生產(chǎn)上不適合，只適合于實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)模操作。

③勻漿法：利用勻漿器進(jìn)行勻漿，在勻漿器內(nèi)加有硬質(zhì)的玻璃磨砂，在

勻漿過(guò)程中，通過(guò)玻璃砂彼此磨擦來(lái)破碎細(xì)胞；此法對(duì)細(xì)胞的破碎程度較高,

但操作規(guī)模小，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。

1.1.2物理破碎法

通過(guò)控制物理因素來(lái)破碎細(xì)胞的方法稱(chēng)為物理破碎法，主要有：

①溫差破碎法：主要是利用反復(fù)凍熔的方法來(lái)破碎細(xì)胞，這種方法僅適

合于實(shí)驗(yàn)室操作。

②超聲波裂解法：通常我們聽(tīng)到的聲音頻率范圍是16-20kHz,頻率高于

20kHz的聲波稱(chēng)為超聲波，實(shí)驗(yàn)證明，超聲波的頻率對(duì)其對(duì)細(xì)胞的破碎作用

21

沒(méi)有明顯影響，影響其破碎作用的因素主要有：超聲發(fā)生器的輸出功率、作

用時(shí)間、介質(zhì)的濃度、粘度、pH等。

目前多采用界于聲波和超聲波之間的頻率(15-25kHz),一般操作條件

為:功率100—150W,介質(zhì)的pH為4—7,在0—10°。條件下處理3—lOmin,

一般情況下，在超聲波處理時(shí)，要間歇進(jìn)行，否則局部產(chǎn)熱，易使酶蛋白變

性而使活。

此法，在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用具有簡(jiǎn)單、快速、效果好等特點(diǎn)，但目前應(yīng)用到規(guī)

?；I(yè)生產(chǎn)還有一定困難。

1.1.3化學(xué)方法

目前有效的化學(xué)方法主要是加入表面活性劑法常用的有：特里頓X-1OO

和吐溫(Tween),其主要是破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增加膜通透性。此法在實(shí)

驗(yàn)室和生產(chǎn)上已成功應(yīng)用。

1.2工業(yè)酶制劑的提取與制備

工業(yè)酶制劑的提取方法很多，并且不同的酶要求采取不同的方法，不同

的廠家，有其自己的獨(dú)特經(jīng)驗(yàn)，采用的工藝技術(shù)路線也不盡相同，下面介紹

一些常用的主要方法。

1.2.1發(fā)酵液的預(yù)處理

發(fā)酵液首先要進(jìn)行過(guò)濾除菌，由于在發(fā)酵液中，有菌體的自溶產(chǎn)生的細(xì)

胞碎片、核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，使得發(fā)酵液很難過(guò)濾；在過(guò)濾前必須

進(jìn)行一定的預(yù)處理過(guò)程。

發(fā)酵液的預(yù)處理的常用方法主要是在發(fā)酵液中加入絮凝劑，常用的絮

凝劑有聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)磺化聚苯乙烯(PolystyreneSulfonate),

絮凝劑加入，主要有以下三方面的作用：①改變發(fā)酵液中'懸浮粒子的物理

特性，如加大粒子的大小，提高粒子的硬度等；②使一些可溶性的膠體物質(zhì)

變成不溶性的沉淀粒子；③降低發(fā)酵液的黏度。

1.2.2酶液的脫色

這一步驟可根據(jù)酶制劑的要求而定，一般食品工業(yè)酶制劑允許含有來(lái)源

中的色素，所以就不脫色；盡管如此，目前大部分工業(yè)酶制劑都要進(jìn)行脫色

處理過(guò)程。

常用的脫色劑有活性炭和離子交換樹(shù)脂，活性炭吸附法，操作效率較高,

脫色較徹底，但在脫色的同時(shí)，也有部分酶蛋白被吸附掉了；離子交換樹(shù)脂

基本上在脫色的同時(shí)，不吸附酶蛋白，現(xiàn)有一種特制的低交聯(lián)度的大孔樹(shù)脂,

22

用于脫色效果很好。

我國(guó)生產(chǎn)了一種脫色專(zhuān)用樹(shù)脂：通用1號(hào)脫色樹(shù)脂，在弱酸性條件下，

其吸附色素，而在堿性條件下便釋放色素，樹(shù)脂的再生方便再生的條件是：

先用5%的NaOH洗脫色素，待色素洗脫干凈后，用蒸儲(chǔ)水洗到中性，再用

5%的HC1（二倍樹(shù)脂床體積）中和樹(shù)脂，再用蒸儲(chǔ)水洗到pH5.0-5.5為止。

1.2.3酶蛋白的初步純化與濃縮

在發(fā)酵液中，酶蛋白的濃度一般不會(huì)太高，并且在發(fā)酵液中混有很多其

它代謝產(chǎn)物，即使是高產(chǎn)菌種。從發(fā)酵液中提取酶制劑，首先要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)

行濃縮和酶蛋白的初步純化，經(jīng)典的方法有以下幾種：

⑴鹽析法

鹽析的基本原理：

蛋白質(zhì)在水中的溶解度與其所帶凈電荷的多少呈正相關(guān)，即蛋白質(zhì)的極

性越強(qiáng)，其溶解度越大，溶液中的離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分，從而減弱蛋

白質(zhì)的水合程度，降低其溶解度；另一方面，電荷部分地中和蛋白質(zhì)分子上

的電荷，使其凈電荷降低或凈電荷消失，促使蛋白質(zhì)析出；此外，溶液中的

鹽離子引起水分子的極化和定向排列降低水分活度；以上三方面的作用，使

可溶性蛋白在水溶液中析出。

在鹽溶液里，蛋白質(zhì)的溶解度的對(duì)數(shù)值與溶液里的離子強(qiáng)度成線性關(guān)

系，人們總結(jié)了以下經(jīng)驗(yàn)公式：

logS=B-Ks.u

S:Protein的溶解度g/1；B為溶液離子強(qiáng)度為零時(shí)的logS,B值受蛋白

質(zhì)性質(zhì)和鹽離子的種類(lèi)以及溶液的溫度pH值的影響；Ks為鹽析常數(shù)，其因

蛋白質(zhì)而性質(zhì)和鹽離子的種類(lèi)不同而不同；U為溶液的離子強(qiáng)度，

M=------------

其中Ci為離子的摩爾濃度；Zi離子所帶電荷數(shù)

如果以經(jīng)驗(yàn)公式做圖如下：

23

鹽析的基本方法：

蛋白質(zhì)的鹽析方法主要有以下兩種：

Ks鹽析法：即蛋白質(zhì)溶液的pH值和溫度固定不變，改變?nèi)芤旱柠}濃度

（離子強(qiáng)度），以達(dá)到沉淀蛋白的作用；此法常用的鹽是硫酸鐵。

B鹽析法：是在一定的離子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤旱膒H值和溫度，以達(dá)到

蛋白沉淀的目的。

在實(shí)際工作中，常用的是Ks鹽析法,利用不同飽和度的（NHOzSCU濃度,

這樣不同的蛋白質(zhì)析出沉淀的（NHD2SO4濃度不同；通過(guò)這種方法可將部分

雜蛋白分離出去，達(dá)到濃縮酶蛋白的目的。

具體操作方法：飽和溶液法和干粉加入法。

鹽析后的脫鹽：透析法和凝膠過(guò)濾法。

⑵有機(jī)溶劑沉淀法

除用鹽析法沉淀酶蛋白外，還可以用有機(jī)溶劑沉淀酶蛋白，關(guān)于有機(jī)溶

劑法沉淀蛋白質(zhì)的原理還不是很清楚。目前選用的有機(jī)溶劑主要有丙酮和乙

醇，并且丙酮的沉淀效果比乙醇好，但丙酮的價(jià)格高，在蒸儲(chǔ)回收時(shí)，損失

較多，所以目前多采用乙醇作沉淀劑。

沉淀酶蛋白所需乙醇濃度受很多因素影響，溶液的離子強(qiáng)度、溫度、pH

值等都影響蛋白質(zhì)的析出，低濃度的鹽離子有促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解的作用，即所

謂的鹽溶效應(yīng)；所以當(dāng)溶液中有低濃度鹽離子時(shí)，乙醇的濃度要增加；溫度

升高蛋白質(zhì)的溶解度增加，沉淀酶蛋白需要的乙醇濃度增加；pH值的影響

因不同的蛋白質(zhì)而不同，一般情況下，當(dāng)溶液的pH值與酶蛋白的等電點(diǎn)一

致時(shí)，需要的乙醇濃度最低，偏離酶蛋白的等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，酶蛋白所帶電荷越

多，蛋白質(zhì)的溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇濃度越高。

一般作為沉淀劑的乙醇濃度是95%,沉淀不同的酶蛋白需要乙醇量稍有

差異，如沉淀枯草桿菌的淀粉酶發(fā)酵液時(shí)，要求乙醇濃度為：每體積的發(fā)酵

液加0.2—0.8體積的乙醇；當(dāng)沉淀蛋白酶時(shí)，加0.8—1.1體積的乙醇沉淀出

的主要是中性蛋白酶，加1」一1.4體積的乙醇時(shí)，沉淀出的主要是堿性蛋白

酶。對(duì)于每一種酶蛋白的沉淀要求乙醇的適宜濃度需要實(shí)驗(yàn)確定。

⑶噴霧干燥法

此法是利用噴霧干燥技術(shù)，直接將液態(tài)酶濃縮成固體酶制劑，此法的

生產(chǎn)效率較高，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，但此法在生產(chǎn)應(yīng)用上有一定的局限性，在噴

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霧干燥時(shí)，需要一定的溫度，在噴霧塔里面進(jìn)如一定溫度的熱空氣，對(duì)于那

些對(duì)熱不穩(wěn)定的酶蛋白不宜使用，現(xiàn)用在生產(chǎn)的主要是生產(chǎn)a-淀粉酶。

⑷膜分離技術(shù)

除上述經(jīng)典的濃縮方法外，目前膜技術(shù)的發(fā)展已應(yīng)用到酶蛋白的濃縮和

分離上來(lái)了，膜分離技術(shù)是以一定孔徑的高分子膜作為過(guò)濾介質(zhì)，將不同大

小、不同性狀、物質(zhì)顆粒或大分子進(jìn)行分離的技術(shù)。

膜分離技術(shù)所使用的膜主要是由丙烯月青、醋酸纖維素、硝酸纖維素、賽

璐粉、尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。在膜分離過(guò)程中，膜的作用是

有選擇性地小于其孔徑的顆粒通過(guò)，將大的顆粒截留，根據(jù)欲分離的物質(zhì)顆

粒的大小，選擇不同孔徑的膜。

根據(jù)物質(zhì)顆粒通過(guò)膜的原理及和推動(dòng)力的不同，膜分離技術(shù)可分為以下

三種：

①加壓膜分離

加壓膜分離是以膜兩側(cè)的流體靜壓差為動(dòng)力，推動(dòng)小于膜孔徑的顆粒通

過(guò)膜孔，大于孔徑的顆粒被截留。根據(jù)膜孔徑大小范圍又分為超濾、微濾和

反滲透三種。

超濾：即超過(guò)濾，本技術(shù)過(guò)濾截留的顆粒直徑在20—2000A(0.2um)

相當(dāng)于分子量1000—5Xl()5Da,并且有多種規(guī)格供選用。此法主要用于酶蛋

白的濃縮和部分純化分離，止匕外，在生化藥業(yè)也常被采用。

此技術(shù)采用的濾膜是由丙烯睛、醋酸纖維素、硝酸纖維素、尼龍等高分

子聚合物制成的高分子膜，膜由兩層構(gòu)成，分表層和基層，表層是濾膜的有

效層，其厚度為0.1—5umum,孔徑大小有多種規(guī)格，現(xiàn)有20—2000A的

系列產(chǎn)品銷(xiāo)售；基層為支持層，主要負(fù)責(zé)膜的強(qiáng)度，其厚度為200—250口m

具有堅(jiān)韌的強(qiáng)度。

影響超濾的因素：膜的過(guò)濾效果用膜的流率來(lái)表示，即每平方厘米膜每

分鐘濾過(guò)的流體量，以ml./cm2.min表示，影響流率的主要因素有膜孔徑的

大小、顆粒性狀、溶液的黏度、流體靜壓。根據(jù)上述影響因素，可在一定范

圍內(nèi)增加流體靜壓(一般控制在50—700kPa)、適當(dāng)提高溶液溫度、增加溶

液的攪拌述度都可在一定程度上提高膜的流率。

超濾技術(shù)在目前無(wú)論是實(shí)驗(yàn)室研究還是酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用都非

常廣泛，其操作簡(jiǎn)單，工作效率高，但對(duì)于那些有小分子輔酶的酶制劑不宜

采用此技術(shù)。

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微濾：又稱(chēng)微孔過(guò)濾，其孔徑較超濾膜的孔徑大，一般在0.2—2.0um

范圍，主要用于過(guò)濾去除細(xì)菌及其它顯微鏡下可見(jiàn)的顆粒物質(zhì)，此法在酶蛋

白的濃縮和分離方面不用，主要勇于礦泉水、無(wú)菌水、軟飲料生產(chǎn)方面除菌

和除去不溶性顆粒物質(zhì)。

反滲透：反滲透膜的孔徑最小，一般在20A,截留分子量為1000D主要

用于分離各種離子和小分子物質(zhì)，此技術(shù)主要用于生產(chǎn)純水，海水的淡化等。

②電場(chǎng)膜分離：將膜分離裝置置于電場(chǎng)下，被分離的物質(zhì)在電場(chǎng)的作用

下，借助電場(chǎng)力作為推動(dòng)力，以達(dá)到分離的目的。利用電場(chǎng)膜分離的物質(zhì)，

必須具備一個(gè)基本條件，那就是其必須是帶電粒子，如果其不帶電荷，或其

靜電荷為零，這樣的粒子就不適宜用此法分離。常用的有以下兩種方法：

電滲析：在一個(gè)電滲槽內(nèi)，用兩塊半通透膜隔成三個(gè)室，中間室裝待分

離液，兩側(cè)室裝水或緩沖液，并裝有電極，接通電源后，帶正電荷的粒子向

負(fù)極滲透，而帶負(fù)電荷的粒子向正極滲透，從而達(dá)到分離的目的。此法多用

于酶液的脫鹽，去除雜質(zhì)等。

離子交換膜電滲析：其裝置與電荷風(fēng)析一致，只是所用的膜較為特殊，

兩塊膜上帶有帶電基團(tuán)，且電性相反，使得帶相同電荷的粒子不能靠近膜，

不致于影響膜的通透性。其應(yīng)用范圍與電滲析一致，當(dāng)溶液的濃度較高時(shí)一，

此法工作效率更高。

③擴(kuò)散膜分離：

擴(kuò)散膜分離主要是指透析方法，將酶溶液裝在由擴(kuò)散膜制成的透析袋

中，再將透析袋置于擴(kuò)散介質(zhì)（緩沖液）中，溶液中的小分子就通過(guò)膜擴(kuò)散

出來(lái)，大分子被截留在袋內(nèi)。此法主要用于沒(méi)蛋白的脫鹽；另外此法還可用

于酶蛋白的濃縮，當(dāng)濃縮酶蛋白時(shí)，是用高濃度的吸水性較強(qiáng)的擴(kuò)散介質(zhì)，

常用的有甘油、聚乙二醇（粉劑）等。

2酶的提純與精制

一般情況下，工業(yè)上用的大多是經(jīng)過(guò)初步提純的酶制劑，不需要進(jìn)行高

度提純和精制，但對(duì)于一種酶來(lái)講，在其應(yīng)用以前，我們必須弄清楚酶的有

關(guān)酶學(xué)特性，要研究酶的性質(zhì)，需要將酶進(jìn)一步提純和精制。下面我們介紹

幾種常用的提純方法。

2.1離子交換層析法：

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此法是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對(duì)各種極性粒子的親合力不同，

而達(dá)到分離目的的方法。

按離子交換劑上的活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，可分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子

交換劑兩種，一般情況下，酶蛋白的等電點(diǎn)在pH7以下，所以在偏堿性溶

液中，酶蛋白帶負(fù)電荷，所以多用陰離子交換劑；對(duì)于有些酶蛋白等電點(diǎn)

較高，可以將其置于偏酸性溶液中，這樣酶蛋白就帶正電荷，分離純化時(shí)應(yīng)

選用陽(yáng)離子交換劑。目前常用的陰離子交換劑有：DEAE?纖維素（二乙基

氨基乙基纖維素）、AE?纖維素（氨基乙基纖維素）,DEAE?SephadexA50；

陽(yáng)離子交換劑有CM?纖維素（竣甲基纖維素）。其中用的最多的是DEAD?

纖維素和DEAE?SephadexA50,DEAE?纖維素適宜用來(lái)分離分子量在

10,000-100,000或以上的蛋白質(zhì)，其穩(wěn)定性好，裝柱后，在洗脫過(guò)程中，柱

床體積基本保持不變，交換容量大，每克交換劑可吸附0.1-1.1毫克酶蛋白。

雖然DEAE?SephadexA50的交換容量更大，（5.0毫克/克交換劑），但其

有一最大的局限性，就是在洗脫過(guò)程中，隨著離子強(qiáng)度的增加柱床體積變小,

影響分離效果。

下面我們以DEAE?纖維素為例介紹其基本操作要點(diǎn)：

①離子交換劑的處理：首先將DEAE?纖維素用蒸儲(chǔ)水浸泡溶漲，然后

按：0.5N鹽酸處理30分鐘以上（不斷攪拌）一蒸儲(chǔ)水反復(fù)洗滌致中性一0.5N

氫氧化鈉處理30分鐘（不斷攪拌）一蒸儲(chǔ)水洗滌致中性。

②洗脫液pH的確定：采用pH梯度測(cè)定。

③裝柱：將交換劑攪拌懸浮起來(lái)，抽氣處理，然后用傾倒法裝柱。

④平衡：裝柱后，用洗脫液進(jìn)行平衡過(guò)夜，流述稍大于洗脫流述，使流

出緩沖液的pH與流入的相同。

⑤上樣：為達(dá)到良好的分離效果，上樣量一般為其交換容量的10-20%,

樣品的pH值和離子強(qiáng)度應(yīng)與洗脫液一致。

⑥洗脫：上樣后，首先用平衡洗脫液洗脫，主要是洗脫下那些與交換劑

結(jié)合力很小或不結(jié)合的雜蛋白；然后，通過(guò)改變洗脫液的離子強(qiáng)度進(jìn)行梯度

洗脫梯度洗脫公式為：

C=C2—（C2—C|）（1—v/V）A2/AI

C2：洗脫液的極限離子濃度；C,：初始離子濃度；V：洗脫液流出體積;

V：貯液室和混合室的總體積；A2：貯液室的截面積；A1；混合室的截面積;

當(dāng)A2/A1等于1時(shí)，上述公式代表一個(gè)直線梯度變化；當(dāng)小于1時(shí)，為凹形

梯度變化；當(dāng)大于1時(shí)，為凸形梯度變化。

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⑦分部收集：利用自動(dòng)分部收集器收集。

⑧合并收集和濃縮：

2.2凝膠過(guò)濾層析

離子交換層析，是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶靜電荷的多少，其與交換劑的親合力

不同，來(lái)將不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)；但對(duì)于那些等電點(diǎn)較接近，所帶靜電荷接近

的蛋白質(zhì)，利用離子交換的方法就無(wú)法分開(kāi)。

凝膠過(guò)濾法是以不同蛋白質(zhì)的分子量大小差異來(lái)將不同蛋白質(zhì)分開(kāi)的

方法。最常用的凝膠是葡聚糖凝膠（Sephadex）,是由葡聚糖和3-1,2環(huán)氧化丙

烷（交聯(lián)劑）相互交聯(lián)而成的中央帶有微孔的球狀凝膠顆粒，根據(jù)凝膠分子

的交聯(lián)程度的不同，共有SephadexGlO、G15、G25、G50、G75、G100>

G150、G200等8種型號(hào)，G50以下的為硬膠，G75以上的為軟膠。G10的

交聯(lián)度最高，分子內(nèi)的網(wǎng)孔最?。籊200的交聯(lián)度最低，分子內(nèi)網(wǎng)孔最大。

（1）凝膠過(guò)濾的基本原理：

（2）操作要點(diǎn)：

①凝膠的選擇：

G25以下主要用于脫鹽和氨基酸，或用于分離分子量在5000以下的小

肽。

G50主要用于分離分子量1500—30000的小分子蛋白。

G753000—80000o