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文檔簡介

細胞傳代培養及細胞計數人癌細胞系傳代培養

1.觀察：培養細胞生長活躍，占瓶底80%-90%，無污染；2.棄廢液：倒掉瓶中培養液，盡量瀝干液體；3.漂洗：加1ml0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,棄去消化液；4.消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液,保留約0.3ml,室溫放置3～5min；5.吹打：鏡下看到細胞收縮變園,加1～2ml含血清培養液,用吸管按順序輕輕吹打，避免出現泡沫；6.計數：取樣,計數,調整細胞濃度；7.接種及培養：按104

細胞/ml接種,37℃、5%CO2

，飽和濕度條件下培養。注意事項

細胞生長至覆蓋培養瓶底面積80%左右時,開始傳代。首次傳代培養應適當提高接種細胞濃度。細胞混雜生長時,可根據需要選擇合適的方法純化細胞。

細胞活力測定－臺盼藍染色法制備單個細胞懸液：105～106／ml染色：0.04%臺盼藍染色1min(9滴細胞懸液＋1滴0.4%臺盼藍)，3min內計數計數：用血細胞計數板鏡下分別計數活細胞（染料拒染）和死細胞（呈淡藍色）計算細胞活力：活細胞率（％）＝［活細胞數／（活細胞數＋死細胞數）］×100細胞密度調整稀釋公式：C1·V1＝C2·V2稀釋前細胞密度C1，溶液體積V1稀釋后細胞密度C2，溶液體積V2細胞計數106/mlCellsusspension105/ml104/ml103/ml0.1ml0.1ml0.1mlMedium0.9ml細胞生長曲線測定－計數法DT=t×lg2÷(lgNt－lgNo)培養細胞的純化方法機械刮除法：用細胞刮刮出不需要的細胞差速粘附法：成纖維樣細胞，上皮樣細胞選擇性酶消化法：金屬管套取需要的細胞密度梯度離心法：細胞漂浮密度，

Ficoll,Percoll克隆化培養法：瓊脂法，有限稀釋法免疫磁珠分離法：細胞表面標志，免疫磁珠速度沉降法：細胞大小，離心淘洗技術電泳分離法：細胞表面電荷細胞培養過程中常見的問題培養液pH值快速偏離：CO2濃度異常，培養瓶蓋過緊；細菌、酵母或霉菌污染培養液出現沉淀：細菌或霉菌污染細胞不貼壁：胰酶過度消化細胞，支原體污染，缺乏附著因子

細胞死亡：孵箱中缺CO2

，孵箱溫度不穩定，細胞凍融損傷，滲透壓改變，培養液中毒性代謝產物堆積細胞生長緩慢：培養液或血清改變，基本促生長成分的消耗、

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