ICS

65.120CCS

B4632 DB

32/T

4367—2022飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定時間分辨熒光免疫層析定量法

of

in

resolved

quantitative

09

江蘇省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布 前 言

.............................................................................

III1

范圍

................................................................................

12

規(guī)范性引用文件

......................................................................

13

術(shù)語和定義

..........................................................................

14

原理

................................................................................

15

試劑和材料

..........................................................................

26

儀器和設(shè)備

..........................................................................

37

樣品制備

............................................................................

38

樣品前處理

..........................................................................

39

標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

........................................................................

310

檢測過程

...........................................................................

311

結(jié)果計算

...........................................................................

412

方法性能

...........................................................................

4DB

32/T

4367—2022 本文件按照GB/T

—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省家禽科學(xué)研究所、上海雄圖生物科技有限公司。本文件主要起草人：施壽榮、汪勁能、張鵬飛、肖蘊祺、胡艷、邵丹、沈一茹、張珊、王強。IIIDB

32/T

4367—20221 范圍本文件規(guī)定了飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、樣品制備、樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線制定、檢測過程、結(jié)果計算和方法性能。本文件適用于飼料原料、濃縮飼料、配合飼料、精料補充料等試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T

飼料

GB/T

20195動物飼料

試樣的制備3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1時間分辨熒光微球

resolved

形狀為球形，直徑在幾納米至幾十微米之間，微球表面或內(nèi)部負(fù)載有熒光物質(zhì)，在受到一定的能量激發(fā)時能夠發(fā)出熒光的微粒，比普通熒光半衰期長。微球表面修飾有合適密度的羧基或其它功能基團(tuán)，用于與蛋白或抗體的共價偶聯(lián)；微球所包理的鑭系稀土元素經(jīng)過了鰲合，無需解離增強步驟。3.2時間分辨熒光免疫層析定量法time

resolved

fluorescence

immunochromatographyquantitative

4 原理試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與時間分辨熒光微球標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合后，抑制了層析過程中標(biāo)記抗體與試紙條

T

線脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗原的免疫反應(yīng)，使

T

線時間分辨熒光強度降低，質(zhì)控線

C線結(jié)合的熒光標(biāo)記物濃度與樣品中玉米赤霉烯酮的濃度無關(guān)。層析結(jié)束后，通過儀器檢測計算試紙條T

線和

C

線的時間分辨熒光強度比值和設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。DB

32/T

4367—20225試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規(guī)定的二級水?！?.1 十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4

12H2O）?！?.2 磷酸二氫鉀（2PO4）。5.3 氯化鉀（）。5.4 氯化鈉（NaCl）。5.5 鹽酸（HCl）。5.6 甲醇（CH3OH）。5.7 蔗糖（C12HO11）。5.8 牛血清白蛋白（BSA。5.9吐溫（C58H114O26）。5.10磷酸鹽緩沖溶液：取

2.178

g

磷酸氫二鈉（5.1）、0.144

g

磷酸二氫鉀（）、0.12

g

氯化鉀（5.3）、

g

氯化鈉（

1

L

水中，用適量鹽酸（5.5）調(diào)

pH

至

6.8～。5.11 提取液：取

甲醇（5.6）用純水定容至

1

L，用于樣品提取。5.12 稀釋液：在

1

L

磷酸鹽緩沖溶液（5.10）中分別加入

g

蔗糖（）、

g

牛血清白蛋白（5.8）和

2.0

g

-20（5.9）混勻，用于樣品上清的稀釋。5.13 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度

。5.14 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液：取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.13）1

mL

于

2

瓶中，用甲醇（5.6）定容，混合均勻，制備成濃度為

100

mg/L

的儲備液。5.15ID

卡：用于存儲標(biāo)準(zhǔn)曲線和項目信息，直接插入熒光免疫定量分析儀使用。5.16 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時間分辨熒光免疫層析定量試紙條（圖

1

μg/kg。試紙條結(jié)構(gòu)圖如下：圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時間分辨熒光免疫層析定量試紙條結(jié)構(gòu)示意圖注：結(jié)合墊包被熒光微球標(biāo)記的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗體，

線包被脫氧雪腐鐮刀菌烯醇封閉抗原，

線包被二DB

32/T

4367—20225.17 陰性樣本：玉米基質(zhì)空白樣本，嘔吐毒素含量＜25

6 儀器和設(shè)備6.1 天平：感量

0.01

g，最大量程

g。6.2 渦旋振蕩器：0

r/min～

r/min。6.3離心機：轉(zhuǎn)速≥4000

。6.4 微量可調(diào)移液器：20μL～200

μL，

～1

mL。6.5 干式恒溫孵育器：37.0℃

±

2.0℃（不帶鼓風(fēng)）。6.6 時間分辨熒光免疫定量分析儀：激發(fā)波長：

±

5

nm、發(fā)射波長：615

nm

±

5

nm，用于讀取試紙條的熒光信號并自動計算定量的檢測結(jié)果。7 樣品制備按

GB/T

GB/T

20195

制樣備用。8 樣品前處理8.1 稱取

1.0

g

±

0.02

g

樣品于

10

離心管中，用移液器（

5

提取液（渦旋振蕩器（6.2

5

，用離心機（）4000

r/min

1

min，上清備用；如果樣品濃度過高，用提取液（）稀釋。8.2 取

100

μL

樣品提取液（），加入到

μL

稀釋液（5.12），混勻后待點樣檢測。9標(biāo)準(zhǔn)曲線制定9.1 空白基質(zhì)溶液制備：取

10

g

離心管中，加入

50

提取液（振蕩器（）振蕩提取

5

min，用離心機（）

r/min

離心

1

min，上清備用。9.2分別吸取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液（）0.000

mL、0.004

、

mL、0.020

mL、0.060

mL、0.120

mL、

mL、0.300

、0.400

mL

于

5

mL

容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液（9.1）定容，分別相當(dāng)于

0

ng/mL、20

ng/mL、50

ng/mL、

ng/mL、

ng/mL、

ng/mL、1000

ng/mL、1500

和

2000

ng/mL

濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。9.3 取

100

μL

標(biāo)準(zhǔn)工作液（9.2）分別加入

600

μL

稀釋液（），混勻后由低濃度到高濃度進(jìn)行檢測（10）。儀器軟件可根據(jù)

T

線信號值與

C

線信號值的比值（T/C）和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的自然對數(shù)值（Inc）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。9.4 同批次試紙條只需建立一次標(biāo)準(zhǔn)曲線，將建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線與項目信息存儲于

ID

卡中，便于樣品隨時隨地檢測。10 檢測過程10.1 將干式恒溫孵育器（6.5）開機，設(shè)置溫度

37℃，待溫度升至

10.2 時間分辨熒光免疫定量分析儀（6.6）預(yù)熱

5

min

后，插入試紙條所對應(yīng)的

卡（DB

32/T

4367—202210.3從鋁箔袋中取出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇熒光免疫定量檢測試紙條（5.16），水平放置于干式恒溫孵育器（10.4 用移液器（）吸取

μL

經(jīng)過前處理的待測樣品（8.2）加入試紙條的加樣孔中，蓋上孵育器蓋開始計時孵育

6

。10.5 孵育結(jié)束后將試紙條（）插入熒光免疫定量分析儀（）的試紙條插槽中，點擊讀數(shù)。11結(jié)果計算樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)

X

計，數(shù)值以微克每千克（μg/kg）表示。儀器按如下公式自動計算。X=

P×V×n×1000m×1000

(1)式中：P—從標(biāo)準(zhǔn)曲