淺析登革病毒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展

感染登格病毒（denv）是人類(lèi)最常見(jiàn)的病毒傳播。據(jù)who統(tǒng)計(jì)，目前世界上大約25億人感染了denv。生活在亞熱帶和亞熱帶的人的風(fēng)險(xiǎn)非常高。世界上每年大約有5000億新的denv患者。DENV屬于黃病毒科黃病毒屬,來(lái)源不明,是有包膜的單鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)約11kb,編碼核衣殼蛋白(C蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)這3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS蛋白),通常通過(guò)埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播,有4種抗原性不同的血清亞型,不同亞型的序列有65%~70%的同源性。任何一種亞型都能引起登革熱(denguefever,DF)、登革出血熱(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS)。大多數(shù)感染者無(wú)臨床癥狀,只有小部分會(huì)出現(xiàn)有癥狀感染,其中最常見(jiàn)的是DF,其臨床表現(xiàn)與感冒引發(fā)的急性高熱相似;嚴(yán)重的會(huì)有DHF,癥狀包括高熱、低血小板計(jì)數(shù)、出血和血管通透性增加;最嚴(yán)重的是以循環(huán)衰竭為特征、危及生命的DSS。DHF和DSS是DENV能引發(fā)的最嚴(yán)重癥狀,且在兒童和15歲以下青少年中更為常見(jiàn)。目前仍無(wú)針對(duì)DENV的有效疫苗上市,但早期發(fā)現(xiàn)和治療干預(yù)可降低其致死性,因此DENV檢測(cè)技術(shù)的研究對(duì)早期診斷治療、降低致死率具有極其重要的意義。1d或再次感染后4d內(nèi)檢出者是否在檢測(cè)細(xì)胞外分離出病毒?DENV血癥可在發(fā)熱前2~3d至初次感染開(kāi)始后5d或再次感染后4d內(nèi)檢出,這段時(shí)間內(nèi)患者的外周血、血清或血漿樣本都可分離出病毒。常用分離方法有敏感細(xì)胞培養(yǎng)分離、成年蚊蟲(chóng)胸腔接種分離和乳鼠腦內(nèi)接種分離。1.1率為“一般不穩(wěn)定因素”的發(fā)生率蚊蟲(chóng)胸腔內(nèi)接種是敏感性最高的病毒分離方法,4種血清型DENV的分離率為71.5%~84.2%。病程早期(前4d)的樣本接種可獲得更高的分離率(85.3%),4d后分離率為65.4%,且初次感染病人的病毒分離率(91.0%)高于再次感染者(77.6%)。1.2老鼠腦移植出生2~4d乳鼠腦內(nèi)注射病人血清或血漿樣本,每日觀察,在死前取腦分離DENV。1.3病毒分離法蚊蟲(chóng)和乳鼠腦內(nèi)接種分離病毒對(duì)技術(shù)、安全性和可行性要求高,花費(fèi)也高,故敏感細(xì)胞系培養(yǎng)分離更加常用。常用的敏感細(xì)胞包括蚊蟲(chóng)傳代細(xì)胞系,如白紋伊蚊細(xì)胞C6/36、偽盾伊蚊細(xì)胞AP-61、安波巨蚊細(xì)胞Tra-284、CLA-1蚊蟲(chóng)細(xì)胞,或哺乳動(dòng)物細(xì)胞LLC-MKZ、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK21、Vero細(xì)胞、Vero-E6細(xì)胞等。細(xì)胞培養(yǎng)分離法的靈敏度只有約40.5%,且有少數(shù)毒株可能不引起細(xì)胞病變,此類(lèi)病例不能通過(guò)細(xì)胞接種的方法檢出。除直接用于診斷外,病毒分離法還為體外實(shí)驗(yàn)如基因測(cè)序、病毒中和及感染實(shí)驗(yàn)提供病毒。病毒分離法診斷DENV的優(yōu)點(diǎn)是可靠,適用于感染早期的疾病監(jiān)測(cè),缺點(diǎn)是耗時(shí)較長(zhǎng)。因此,病毒分離法目前已極少用于臨床診斷。2免疫探索的試驗(yàn)感染DENV后的急性期后期,血清學(xué)檢測(cè)是較好的方法。DENV的常用血清學(xué)檢測(cè)方法包括血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutinationinhibition,HI)、空斑減少中和試驗(yàn)(plaquereductionneutralizationtest,PRNT)、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)(indirectimmunofluorescenceassay,IFA)、IgM/IgG捕獲ELISA法、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(dotimmune-bindingassay,DIBA)、免疫印跡和快速層析法。2.1血凝抑制試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)敏感性高,重復(fù)性好,操作簡(jiǎn)便,檢出率高于病毒分離法,曾是DENV血清學(xué)檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。此法的優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)所需試劑配制方便,可根據(jù)血清滴度的不同判斷初次感染或二次感染,HI滴度≥1∶2560則為二次感染,<1∶2560則為初次感染。血凝抑制試驗(yàn)也有諸多缺點(diǎn):(1)待檢測(cè)的血清樣本必須先經(jīng)預(yù)處理,以去除紅細(xì)胞凝集的非特異性抑制劑;(2)準(zhǔn)確的HI測(cè)試需要急性期和恢復(fù)期的血清樣本,急性期和恢復(fù)期血清樣本的滴度相差4倍或以上才能確診近期感染;(3)方法缺少特異性,不能區(qū)別DENV感染和其他相近種類(lèi)的病毒感染,如乙型腦炎病毒、西尼羅河病毒感染,因此在其他黃病毒感染也高發(fā)的地區(qū)使用受限;(4)易發(fā)生交叉反應(yīng)且不能區(qū)分DENV的血清型。因此,血凝抑制試驗(yàn)現(xiàn)已逐漸被其他更加快速準(zhǔn)確的方法所取代。2.2prnt試驗(yàn)空斑減少中和試驗(yàn)可用于檢測(cè)感染過(guò)DENV的患者的血清分型。基本方法是在不同稀釋率的病人血清中加入定量的病毒,接種到預(yù)先準(zhǔn)備好的單層細(xì)胞中培養(yǎng)數(shù)天,統(tǒng)計(jì)蝕斑數(shù),計(jì)算該血清的蝕斑中和效價(jià)。最終滴度是使蝕斑減少50%~90%的血清的最高稀釋率。DENV初次感染者的血清能使蝕斑數(shù)減少90%。二次感染和抗體依賴性增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)中,PRNT試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)中蝕斑減少50%~70%。PRNT是鑒別不同種類(lèi)黃病毒的血清學(xué)檢查金標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)PRNT法的缺點(diǎn)是耗時(shí)較長(zhǎng),需要活病毒,對(duì)操作人員技術(shù)要求高,且不能用于大量臨床或流行病學(xué)樣本的高通量分析。目前已有基于PRNT的改良法,使用偽病毒報(bào)告顆粒可有效檢測(cè)DENV的4種血清型。2.3igm/igg檢測(cè)此法的基本過(guò)程是以人抗IgM或IgG包被酶標(biāo)板,病毒抗體、病毒抗原、二抗和酶按順序相互結(jié)合孵育,最后用分光光度計(jì)檢測(cè)顯色程度代表不同滴度。鼠腦來(lái)源的病毒血凝素抗原或細(xì)胞來(lái)源的病毒抗原都可作為病毒抗原使用,兩者的敏感性和特異性并無(wú)顯著差異。目前IgM/IgG捕獲ELISA法是判斷初次感染和再次感染的常用指標(biāo)。目前已有多種商品化ELISA試劑盒可用于DENV抗體檢測(cè),特異性和敏感性也很不錯(cuò)。ELISA法的優(yōu)點(diǎn)是操作方便迅速,IgM-ELISA可檢測(cè)出近期感染,IgM與IgG的吸光度比值可鑒別是初次還是二次感染。但ELISA法有2個(gè)缺點(diǎn),一是血清中的風(fēng)濕因子會(huì)影響DENVIgM的檢測(cè)特異性,二是ELISA法用全部病毒抗原來(lái)檢測(cè)登革特異性抗體,4個(gè)血清型之間易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。3denv的生物檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的病毒分離法相比,分子生物學(xué)檢測(cè)方法的敏感性更高、更快速,十幾年來(lái)發(fā)展迅速,有良好的應(yīng)用前景。3.1denv基因回復(fù)突變法依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA)是一種以RNA為模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增的方法,可用于DENV擴(kuò)增。此法借助逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶和2對(duì)特異性引物實(shí)現(xiàn)。這種化學(xué)發(fā)光法操作簡(jiǎn)便,靈敏度為98.5%,特異性為100%,可檢測(cè)樣本中低于25PFU/mL的DENVRNA,適合在登革暴發(fā)地區(qū)快速檢測(cè)。3.2lamp的檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一種等溫?cái)U(kuò)增方法,其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物,不需要熱變性的DNA作為模板,在恒溫下就可高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。利用鏈置換DNA聚合酶在等溫(63℃左右)條件下保溫30~60min即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP的結(jié)果判斷有多種方法,陽(yáng)性產(chǎn)物電泳可見(jiàn)特殊的階梯狀條帶,或加入熒光染料觀察熒光強(qiáng)度,或顏色改變判斷是否為陽(yáng)性反應(yīng),借助副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀離心后產(chǎn)生白色沉淀,或通過(guò)濁度儀實(shí)現(xiàn)定量。該方法適合基礎(chǔ)條件較為薄弱的基層或現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室,反應(yīng)時(shí)間短,不需要特殊儀器設(shè)備,肉眼可觀察結(jié)果,具有很強(qiáng)的實(shí)用性。LAMP技術(shù)目前在國(guó)內(nèi)外得到廣泛推廣及應(yīng)用,RT-LAMP法可用于DENV檢測(cè)。3.3逆轉(zhuǎn)錄并pcr擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法(transcriptionmediatedamplification,TMA)是目標(biāo)序列單鏈RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下,引物1引導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,形成RNA/DNA雜交雙鏈分子,逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解后,引物2引導(dǎo)合成雙鏈DNA,由于在引物1上設(shè)計(jì)有T7啟動(dòng)子結(jié)合區(qū),雙鏈DNA在T7RNA多聚酶作用下轉(zhuǎn)錄出100~1000個(gè)目標(biāo)RNA序列,這些RNA又可作為模板進(jìn)行下一個(gè)循環(huán),整個(gè)反應(yīng)是一個(gè)自催化過(guò)程。TMA檢測(cè)DENVRNA在RT-PCR檢測(cè)陰性的急性期血清樣本中有80%的檢出率,在RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的急性期血清樣本中檢出率達(dá)100%,即總檢出率達(dá)89%。3.4rt-pcr和rflp法實(shí)時(shí)PCR(realtime-PCR,RT-PCR)是目前快速診斷DENV的最好方法之一,靈敏度范圍58.9%~100%,檢測(cè)閾0.1~3.0PFU[21,22,23,24,25,26,27]。RT-PCR的定量用熒光色素實(shí)現(xiàn),目前常用的2種是能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結(jié)合的熒光探針如TaqMan探針,以及能在雙鏈DNA中插入的特異熒光色素如SYBRgreenⅠ。由于SYBRgreenⅠ可結(jié)合到任何雙鏈DNA,包括引物二聚體和非特異性產(chǎn)物上,影響目標(biāo)產(chǎn)物的濃度檢測(cè),因此對(duì)引物的要求較高。TaqMan熒光探針雜交法只能在單管mRNA上使用,試驗(yàn)費(fèi)用較高昂。RT-PCR引物來(lái)自DENV基因組的不同區(qū)域,可用于臨床檢測(cè)DENV及確定血清型。Lanciotti最早建立的兩步法巢式RT-PCR中,2組與C/prM區(qū)對(duì)應(yīng)的引物比較常用,包含用于第一輪擴(kuò)增的外引物及鑒定4種血清型的特異性引物。經(jīng)過(guò)2次PCR擴(kuò)增,病毒基因組的信息量擴(kuò)大,有助于提高檢測(cè)的敏感性,方便檢出病毒,同時(shí)還可鑒定具體的血清型及分辨混合感染。為降低樣本交叉污染帶來(lái)的假陽(yáng)性,Harris等建立了一種單管復(fù)式RT-PCR法,對(duì)1~4血清型DENV的最低檢測(cè)閾分別為1、50、1、30PFU。有研究證明一步法比兩步法具有更高的檢出率,值得臨床實(shí)驗(yàn)室推廣。目前RT-PCR法和其他方法聯(lián)用診斷DENV越來(lái)越常見(jiàn)。如將一步法RT-PCR與單酶切-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)相結(jié)合,可以更快速有效地鑒定DENV分型。Vorndam首先報(bào)道了RT-PCR/RFLP技術(shù)可鑒別DENV的地理亞群,但需要擴(kuò)增整個(gè)病毒基因組。經(jīng)Gaunt和Gould改進(jìn)后,RT-PCR/RFLP法可鑒別90%的已知E基因序列的黃病毒。2012年Ortiz等建立了一種新的一步法RT-PCR與單酶RFLP法結(jié)合,只需24h就可鑒別DENV的4種血清型、黃熱病病毒、西尼羅河病毒和圣路易斯腦炎病毒,且特異性高于95%。由于PCR反應(yīng)的引物、酶、緩沖液、反應(yīng)條件、病毒的基因組靶區(qū)域和PCR儀都可能影響PCR結(jié)果,而各地的條件都不相同,因此很難界定哪一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法更好,需要結(jié)合本地的實(shí)際條件加以應(yīng)用。各種分子生物學(xué)檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一,需要進(jìn)一步研究摸索,相關(guān)的分子學(xué)檢測(cè)試劑盒也正在開(kāi)發(fā)。3.5材料和硬件的選擇生物傳感器是生物診斷設(shè)備,既可定性也可定量檢測(cè),具有快速、靈敏、特異性高的優(yōu)點(diǎn),如能實(shí)現(xiàn)便于攜帶、自動(dòng)化程度高的試劑盒商業(yè)化要求,將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。DENV生物傳感器在2000年開(kāi)始出現(xiàn),并不斷得到改進(jìn)[34,35,36,37,38,39,40]。人類(lèi)的基因組DNA可能會(huì)影響病毒RNA的選擇,因此生物樣本的純化和化學(xué)修飾十分重要。微流體設(shè)備(芯片實(shí)驗(yàn)室)和基于一次性芯片的技術(shù)可用于樣本預(yù)處理,然而考慮到場(chǎng)地要求、設(shè)備要求和資金能力,這些設(shè)備可能不完全適于快速檢測(cè)試驗(yàn)的基本要求。當(dāng)前大多數(shù)DENV生物傳感器類(lèi)型為壓電晶體生物傳感器、光生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器。在壓電式傳感器中,2種不同的單克隆抗體固定在一個(gè)壓電式傳感器上,它們之間是一個(gè)免疫芯片,傳感器可探測(cè)糖蛋白E和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1,還有的使用分子印跡聚合物來(lái)識(shí)別登革病毒NS1蛋白的抗原決定部位。這樣的設(shè)計(jì)規(guī)避了合成單抗的使用,可獲得較高的靈敏度和特異性。最近,芯片技術(shù)發(fā)展為通過(guò)互補(bǔ)的寡核苷酸特異性雜交進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR,效果與RT-PCR相同。此方法易發(fā)生內(nèi)源性和外源性互相干擾,因此對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求很高。一種化學(xué)發(fā)光的光學(xué)纖維免疫傳感器能與酶聯(lián)免疫吸附法獲得類(lèi)似的DENV檢測(cè)效果,且靈敏度更高,或可用于無(wú)癥狀患者的