不同溶出介質(zhì)中熟大黃的體外溶出比較

中醫(yī)藥劑量-反應(yīng)關(guān)系的研究是確保中醫(yī)藥臨床療效的基礎(chǔ)和前提。然而,一定劑量下中藥效應(yīng)的發(fā)揮必須依賴于活性成分在體內(nèi)的溶出、吸收狀況,對于難溶性藥效組分,其溶出是吸收的限速過程,溶出速度的快慢將直接影響到藥物的生物利用度。因此,了解不同溶出介質(zhì)下有效成分的溶出特性,對于客觀準確評價藥物療效具有現(xiàn)實意義。大黃是臨床常用的大宗藥材,常以提取物使用。然而,在藥典收載的大黃復(fù)方大黃蟄蟲丸中,大黃以其炮制品熟大黃生粉直接入藥。體內(nèi)不同部位其溶出環(huán)境往往不同,相同劑量條件下,熟大黃在體內(nèi)的溶出特性可能不盡相同。為此,筆者以熟大黃為研究對象,考察其在4種不同溶出介質(zhì)中鞣質(zhì)和蒽醌類成分的溶出量差異,從體外溶出的角度探討影響中藥量-效關(guān)系的可能因素,為進一步研究體內(nèi)吸收代謝提供參考。儀器和試劑盒1.藥品、成分配比及色譜檢定所大黃購于甘肅禮縣,經(jīng)解放軍302醫(yī)院肖小河研究員鑒定為掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根及根莖。對照品大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素購自中國藥品生物制品檢定所(批號分別為110795-200505、110796-200716、110757-200206、110758-200610、110799-200806、110725-200608、877-200001、110878-200102),甲醇(分析純及色譜純,由北京泰博昌生物技術(shù)有限公司提供)。其余試劑均為分析純。方法1.細粉的制備取生大黃1kg,至煮制容器內(nèi),用300g黃酒拌勻,悶約1-2h至酒被洗凈,裝入燉藥罐內(nèi),密閉,隔水燉約24-32h,至大黃內(nèi)外均呈黑色時,取出,真空干燥,粉碎成細粉(100目)備用。2.對照品溶液的制備分別精密稱取大黃素等5種蒽醌對照品適量,加甲醇分別制成每1mL含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚各80μg,大黃酸、大黃素甲醚20μg的儲備液,該儲備液在4℃避光冷藏可穩(wěn)定保存2個月以上。分別精密量取上述對照品儲備液適量,置于同一量瓶中,加入甲醇溶解并稀釋至刻度,混勻,即得1mL中含蘆薈大黃素(aloeemodin)、大黃酸(rhein)、大黃素(emodin)、大黃酚(chrysophanol)、大黃素甲醚(physcin)各3μg。分別精密稱取沒食子酸(gallicacid)、兒茶素(catechin)、表兒茶素(epicatechin)對照品適量,加50%甲醇-水制成每1mL含沒食子酸、兒茶素各200μg,表兒茶素100μg的儲備液,分別再精密量取上述對照品儲備液適量,用50%甲醇-水制成每1mL含沒食子酸20μg,含兒茶素80μg,含表兒茶素50μg的鞣質(zhì)類混合對照品液。3.色譜及色譜柱的制備取熟大黃約3g,精密稱定,采用藥典漿法,分別以pH1.2人工胃液、pH6.8(相當(dāng)于小腸液pH值)人工腸液、pH7.0脫氣水和pH8.34(相當(dāng)于大腸液pH值)磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì),溫度37℃,轉(zhuǎn)速50r/min,分別于5、10、30、60、90、180、360min取樣10mL,補加等體積等溫脫氣的溶出介質(zhì),取2mL樣品用0.22μm的微孔濾膜過濾,取濾過液測定蒽醌及鞣質(zhì)類成分的直接溶出量;剩余8mL+8%HCl8mL于120℃油浴鍋上加熱回流1h,放冷,取1mL用0.22μm的微孔濾膜過濾,取濾過液測定鞣質(zhì)類成分水解后的含量,剩余15mL至分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗滌容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷層,酸液再用三氯甲烷提取3次,至三氯甲烷無色,每次10mL,合并三氯甲烷液,減壓回收溶劑至干,殘渣用2mL甲醇充分溶解,用0.22μm的微孔濾膜過濾,測定蒽醌成分萃取后的含量。色譜柱:WatersAcquityBEHC18色譜柱(50mm×2.1mm,1.7μm),柱溫35℃。流動相組成:流動相A:0.1%磷酸-水,流動相B:甲醇,線性梯度洗脫程序:0-1.5min,100%A;1.5-2.0min,100%-95%A;2.0-3.5min,95%-86%A;3.5-5.0min,86%-72%A;5.0-8.0min,72%-64%A;8.0-10.0min,64%-52%A;10.0-13.0min,52%-30%A;13-16.0min,30%-16%A。流速0.75mL/min,檢測波長254nm;進樣量5μL;理論塔板數(shù)按大黃素計算,應(yīng)不低于3000。鞣質(zhì)類成分在不同介質(zhì)中的溶出差異大黃各標準品及樣品液UPLC相色譜圖,見圖1。由圖1可知,大黃鞣質(zhì)和蒽醌類成分在液相上能較好的分開。為便于評價溶出樣品各成分的變化關(guān)系,故在預(yù)實驗中對比研究了生大黃與熟大黃化學(xué)成分的差異。發(fā)現(xiàn),生大黃炮制成熟大黃后,已檢測不到兒茶素,這一結(jié)果與文獻報道一致,因此,本研究以沒食子酸為代表來評價鞣質(zhì)類成分在不同介質(zhì)中的溶出差異。鞣質(zhì)類成分(以沒食子酸為指標)在4種不同溶出介質(zhì)中溶出速度存在差異(見表1-表2),在pH8.34的磷酸鹽緩沖液中溶出最快,30min即達到最大溶出,達到最大溶出先后順序為:pH8.34>pH6.8>Water≈Pepsin(人工胃液);但鞣質(zhì)類成分在不同介質(zhì)中溶出量差異不明顯。3.蘆薈大黃素、大黃素、小黃素、小黃素甲醚檢測大黃直接溶出后,5種游離蒽醌中僅大黃酸在pH8.34磷酸鹽緩沖液和pH6.8人工腸液中能檢測到,而蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚幾乎檢測不到。同時,從表3可看出,大黃酸在pH8.34磷酸鹽緩沖液中的溶出量除10min取樣點處低于pH6.8人工腸液中的溶出量外,其他各取樣點均高于在人工腸液中的溶出量,考慮到大黃酸為酚酸類物質(zhì),具有一定的弱酸性,因此在偏堿性的溶出介質(zhì)中溶出較多。4.不同介質(zhì)中中各個衍生物體含量的變化游離蒽醌衍生物為脂溶性物質(zhì),在水中的溶解度極小,因此,直接溶出的蒽醌類物質(zhì)主要是結(jié)合蒽醌。筆者所測5種蒽醌衍生物主要由結(jié)合蒽醌水解生成,故水解后測得不同時間點蒽醌衍生物含量越高,結(jié)合蒽醌在4種溶出介質(zhì)中溶出量越多,溶出速度越快。5種蒽醌衍生物在不同溶出介質(zhì)中的含量見圖2。總體而言,5種蒽醌衍生物60min后,在各溶出介質(zhì)中含量基本達到最高,同時,由于蒽醌類成分具有一定的弱酸性,在酸性的人工胃液中溶出最慢,且溶出量最少,具體到每個蒽醌衍生物體,其含量存在一定差異,總結(jié)如下:(1)蘆薈大黃素在pH8.34磷酸鹽緩沖液中含量最高,90min前在pH6.8人工小腸液中的含量高于在水中的含量,之后含量下降,但在180min后含量還在繼續(xù)增加;(2)大黃酸含量在不同溶出介質(zhì)中存在一定規(guī)律,即介質(zhì)pH值越大,含量越高,含量順序為:pH8.34>Water>pH6.8>Pepsin。另外,與直接溶出測得溶出量比較,大黃酸水解后在pH8.34和pH6.8的介質(zhì)中含量均增加;(3)大黃素在pH8.34和脫氣水中含量相對較低,在180min時含量仍在繼續(xù)增加,在pH6.8人工腸液中,60min前大黃素含量已達到最大,之后含量開始下降,但仍高于在人工胃液中各點的含量;(4)大黃酚在各介質(zhì)中含量大小的總體趨勢為:Water>pH8.34>pH6.8>Pepsin;(5)大黃素甲醚的含量變化情況與大黃酚類似,只是含量較低。由圖2可以看出,水解后5種蒽醌在60min(1h)時含量基本達到最高,故筆者以1h內(nèi)5種蒽醌含量變化為指標,評價各成分所對應(yīng)的結(jié)合蒽醌在不同介質(zhì)中的溶出快慢:大黃素甲醚在各介質(zhì)中含量變化最慢,其次是大黃素,而同一蒽醌衍生物在pH1.2人工胃液中含量變化最慢,在pH8.34磷酸鹽緩沖液、pH6.8人工腸液和pH7.0水中含量變化相對較快,提示蒽醌類成分(主要指結(jié)合型蒽醌)在小腸和大腸處溶出可能快于在胃里的溶出,同時,大黃素和大黃素甲醚所對應(yīng)的結(jié)合蒽醌在不同介質(zhì)中的溶出較慢。不同藥物中不同溶出性質(zhì)的比較大黃在我國應(yīng)用歷史悠久,療效廣泛,具有瀉熱通腸,涼血解毒,逐瘀通經(jīng)的功效。臨床主要以生大黃和制大黃入藥,而制大黃中以熟大黃應(yīng)用較多,如大黃蟄蟲丸、新清寧片、羚羊清肺丸等常用復(fù)方中均用熟大黃且多以原粉直接入藥。研究熟大黃的溶出特性對評估藥物吸收情況有重要參考意義。蒽醌類成分是大黃的重要藥效成分,對其研究已較為清楚;而對于大黃中另一類成分——鞣質(zhì)的研究則相對較少。隨著對大黃新功能的深入探討,如今鞣質(zhì)作為一種藥用有效成分也逐漸為人們所認識,特別是大黃鞣質(zhì)降低血清尿素氮的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了國內(nèi)外學(xué)者的極大興趣和普遍關(guān)注。筆者以熟大黃為研究對象,同時考察了蒽醌和鞣質(zhì)類指標成分,通過模擬人體胃腸pH值環(huán)境,比較熟大黃在4種不同溶出介質(zhì)中的溶出差異。由于游離蒽醌在水、人工胃液、人工腸液及磷酸鹽緩沖液中溶解度較小,故文章采用溶出絕對量作為考察指標。本研究發(fā)現(xiàn),鞣質(zhì)類成分(以沒食子酸為指標)的溶出量大于蒽醌類成分,鞣質(zhì)類成分在不同pH介質(zhì)中溶出速度有一定差異,但溶出量差異不明顯。而大黃蒽醌類成分在溶出介質(zhì)水解前只能檢測到大黃酸,該結(jié)果與相關(guān)文獻報道類似;溶出介質(zhì)水解后5種蒽醌成分均可檢測到,提示大黃蒽醌溶出主要以結(jié)合型為主;蒽醌成分在酸性的人工胃液中的溶出量最低,在近中性和偏堿性溶液中溶出量相對較高,尤其是在pH8.4的磷酸鹽緩沖液中溶出較好,提示大黃蒽醌類成分(主要指結(jié)合型蒽醌)在腸道尤其是大腸部位溶出較好,通過制劑學(xué)手段延長大黃在腸道停留時間將有助于提高蒽醌成分生物利用度。由于含大黃的口服中成藥不同劑型在消化道各段的崩解行為可能不同,必然導(dǎo)致不同劑型間的體內(nèi)溶出吸收存在較大差異,影響中成藥臨床應(yīng)用的準確性和穩(wěn)定性。中成藥口服溶出行為評價對于保障臨床用藥安全