液相色譜串聯質譜法測定青花菜中l-硒甲基硒代半胱氨酸的含量

1富硒青花菜中含硒化合物的檢測遼寧能有效地扮演其他養分的生物學功能。研究發現,人體和動物體內硒的吸收、作用效果和毒性等與攝入硒的化學形態密切相關。L-硒甲基硒代半胱氨酸(SeMC)是比硒蛋氨酸(SeMet)和亞硒酸鈉具有更高生物活性的一種小分子有機含硒化合物,可通過誘導細胞凋亡等機制發揮抑癌作用。近年來,多種現代分析技術被嘗試用于富硒生物樣品中含硒化合物的鑒定和定量分析,最值得推薦的是液相色譜質譜聯用技術,具有靈敏度高,專屬性好,分析速度快等特點。Finley等已運用ICP-MS技術證實富硒青花菜含有SeMC。本研究擬建立測定富硒青花菜中SeMC的液相色譜串聯質譜法(LC-MS-MS),并通過方法學考察,以獲得高效、準確、特異性和實用強性的定量檢測富硒青花菜中SeMC的分析技術。2實驗部分2.1美國法上的紡粘設備1100高效液相色譜系統(美國安捷倫公司);API4000三級四極串聯質譜儀(美國應用生物系統公司);MettlerAE163萬分之一分析天平(美國MettlerToledo);VORTEX-TGENIE渦流混勻器(scientificindustry);Barnstead純水機;acrodisc25mmsyringe0.2μm過濾器(美國Pall公司);電子恒溫浴鍋。甲醇為色譜純(美國Fisher公司);99%七氟丁酸(Lancaster公司)。CH3-Se-CH2-CH(NH2)-COOHSeMC(美國PharmacySe公司)。實驗用水由Barnstead純水系統制備。2.2合成青花菜總硒含量的測定市購普通青花菜,富硒青花菜采自我國高硒地區,經洗凈、陰干、切碎、60℃烘干后,研磨,過0.16mm篩,采用2,3-二氨基萘熒光分光光度法測定這兩種青花菜總硒含量分別為13和320mg/kg。準確稱取0.1g樣品于50mL具塞離心管中,加入5mL18.2MΩcm的純水,沸水浴加熱提取1h,期間,每隔20min渦流混勻一次。提取液室溫放置自然冷卻,用0.2μm濾器過濾。2.3氟丁酸溶液10.1%7%v.7WatersSymmetryC18色譜柱(150mm×3.9mmi.d.,5μm),柱溫20℃。流動相:甲醇-0.1%七氟丁酸水溶液(30∶70,V/V)。流速:500μL/min;進樣量為10μL。ESI離子源,正離子電離方式,電離電壓5500V;霧化氣:高純氮氣;碰撞活化(CAD)參數為6;氣簾氣(CUR)20psig;霧化氣(GS1)35psig,輔助氣(GS2)40psig;離子源溫度(TEM):450℃;掃描方式:多反應離子監測(MRM)。3結果與討論3.1流動相的影響比較水、甲醇、丙酮和二氯甲烷等溶劑對青花菜中SeMC的提取效率。由于純水提取效率較高,實驗選擇純水作為提取溶劑。實驗發現,沸水浴加熱提取優于常溫超聲方法。考察不同比例的甲醇水溶液(70%、50%、30%和20%)作流動相的情況,比較發現,在30%甲醇條件下,SeMC在樣品中與雜蜂分離較好,但峰形存在拖尾現象。流動相中添加了少量七氟丁酸,峰形有較好改善。綜合考慮分離效果、分離時間,選擇甲醇-0.1%七氟丁酸水溶液(30∶70,V/V)為流動相。3.2質譜分析結果首先經Q1全掃描選擇母離子,然后進行二級質譜掃描,得到化合物的二級質譜圖(圖1)。根據質譜圖分析結果,選定進行MRM掃描的離子通道SeMCm/z184.0→(167.0;94.9)。在選定的儀器條件下,標準溶液液相色譜圖見圖2a。從圖2a可以看出,SeMC的保留時間為3.86min,色譜行為良好。3.3青花菜基質對富硒離子檢測的影響普通青花菜在保留時間位置并沒有檢測到SeMCm/z184.0→(167.0;94.9)的離子對色譜峰,表明普通青花菜基質不會干擾采用LC-MS-MS技術檢測富硒樣品中SeMC的含量(見圖2b)。富硒青花菜樣品中SeMC保留時間和標準品一致,加標后,保留時間不變,信號增高,見圖2c和2d。3.4標準曲線和檢出限在普通青花菜中添加不同量的標準溶液,按照2.3和2.4所述樣品前處理方法及儀器條件進行測定,以樣品的濃度(x,μg/L)為橫坐標,峰面積(y)為縱坐標(外標法),根據離子對響應強度,選擇SeMCm/z184.0/94.9作為定量分析的離子對,獲得標準曲線回歸方程(n=6)為:SeMC(184.0/94.9):y=1940x+395(r=0.9993)。結果表明,SeMC在0～200μg/L的濃度范圍內線性關系良好。采用信噪比S/N=3來計算,得到本方法的最低檢出限為SeMC0.1mg/kg。采用信噪比S/N=10來計算,得到本方法的最低定量濃度為SeMC0.5mg/kg。3.5富硒青花菜樣品的質譜行為取普通青花菜樣品0.1g,按照前面所述方法配制3個濃度的樣品,每一濃度進行6樣本分析,連續測定6d,并與標準曲線同時進行。求算回收率和精密度,結果見表1。我國高硒地區采集的青菜花,經處理后用液相色譜-串聯質譜聯用儀進行分析測定,計算SeMC的含量為7.91mg/kg。研究結果表明:LC-MS-MS通過陽離子對的選擇,能有效排除含有大量雜質的植物提取液基質的干擾,在有效分離含硒化合物的同時,能在線完成富硒青花菜樣品中SeMC中的選擇性檢測。此外,Finley等發現SeMC為青花菜的主要含硒化合物