神奈川現象檢測及其產生耐巖溶性弧菌的初步研究

嗜血性嗜血性主要分布在沿海水域、海與海之間的交匯處和海洋中。它是沿海地區引起食物中毒的重要病原體。日本學者認為副溶血性弧菌的神奈川現象與腸道致病性間有著密切的關系,此陽性反應是由副溶血性弧菌產生的耐熱的直接溶血毒素(TDH)所造成的。據Kato氏報道,幾乎所有病人大便中分離的副溶血性弧菌在神奈川現象培養基上都顯示溶血,而海水中分離的菌株僅有1%顯示神奈川現象陽性。采用一般的細菌培養分離方法很難從環境及食品中檢出神奈川現象陽性并且產生TDH的副溶血性弧菌,因此對利用免疫磁珠法(ImmunomagneticSeparation)分離環境及食品中產生TDH副溶血性弧菌的可行性進行了研究。免疫磁珠法,是將磁性微株與特定K型抗血清混合后,使K抗體吸附于磁株上,再將樣品與免疫磁株振蕩混勻,樣品中帶有特定K抗原的細菌就會與抗體發生特異性結合而被吸附于磁株上,在磁場的作用下,吸附了樣品中帶有特定K抗原的細菌的磁株就會向磁極方向移動并聚集在容器內壁,將樣品液體移出,從而達到有效地濃縮和收集目的菌的方法。1材料和方法1.1樣本來源1999年7月~2000年6月由日本靜岡縣內漁港采集的海水29份、海泥25份,2000年6月~10月采集的市售蛤15份。1.2增菌劑、免疫磁珠法1.2.1取海水1L經濾膜過濾后,將濾膜置入100ml堿性蛋白胨水中,37℃培養18hr海泥25g置入225ml堿性蛋白胨液中,37℃培養18hr;取蛤肉25g置于添加2%NaCL的胰胨大豆培養液225ml中,37℃培養6hr后,轉種氯化鈉多粘菌素B肉湯培養18hr。培養基系日水制藥株式會社和榮研化學株式會社產品。1.2.2PCR法檢測上述培養液中tdh遺傳因子存在與否。PCR反應條件:93℃,1.4min,55℃,1.8min,72℃,1.0min,35個循環。1.2.3對PCR法檢測tdh陽性的海水、海泥進行氯化鈉多粘菌素B肉湯18hr選擇性第二次增菌后,再行多粘菌素B肉湯6hr第三次增菌培養;對蛤肉進行PCR法檢測tdh陽性的多粘菌素B肉湯6hr第三次增菌培養。1.2.4使用免疫磁珠法使第三次增菌液中目的菌與免疫磁珠結合1.2.4.1免疫磁珠的制備:取磁株液(DYNAL社生產的DynabeadsM-280Sheepanti-RabbitIgG)0.5ml加入1ml洗液(PBS-Tween)中混勻,3000rpm離心2min,棄去洗液,清洗2次后,再加入0.5ml洗液,使磁株懸浮于其中,然后加入副溶血性弧菌K6免疫血清1ml,于4℃環境條件下,垂直于水平面輕緩旋轉振蕩18hr,再用1ml洗液洗凈5次后,將免疫磁株放4℃冰箱保存備用。1.2.4.2將1ml檢樣第三次增菌液加入盛有20μl免疫磁株的小管中,于室溫垂直于水平面輕緩旋轉振蕩30min后,將小管置于磁場旁3min,移出樣品液體,再加入1ml洗液,與免疫磁株混勻后,置于磁場旁3min,吸出洗液,重復洗3~5次后,加入100μlPBS-Tween,使吸附有目的菌的免疫磁株與之混勻。1.2.5分別取免疫磁株處理液50μl劃線接種2塊TCBS平板(劃線需使用非金屬工具)。1.2.6挑取TCBS平板上藍綠色菌落點穿刺接種于神奈川現象培養基。有溶血現象者則判定為TDH陽性。1.2.7對TDH陽性菌株進行血清凝集反應,并同時進行反相被動血球凝集檢驗,以對其產生的TDH予以確認。2神奈川現象陽性患者及其分離株的分離率2.1由PCR法測得的52%(15/29)的海水、12%(3/25)的海泥及53%(8/15)蛤肉中的副溶血性弧菌帶有tdh遺傳因子。對tdh陽性檢體培養液用免疫磁株進行對帶有特定K抗原的菌株的濃縮、收集后,接種于神奈川現象培養基,分別從1份海水、1份海泥和3份蛤肉中檢出神奈川現象陽性并且產生TDH(反相被動血球凝集均為陽性反應)的副溶血性弧菌,血清型為O3:K6。該血清型與同年靜岡縣境內發生的副溶血性弧菌食物中毒患者分離株中檢出率最高的血清型一致。2.2是否使用免疫磁珠對帶有特定K抗原的菌株進行濃縮、收集,TDH陽性株的分離率也有著明顯的差別(見附表)。經免疫磁株處理后的分離率遠遠高于未經處理樣品,據文獻報道,使用免疫磁珠法從10份海水中的4份中檢出了TDH陽性副溶血性弧菌,而同時對3份TDH陽性檢體未使用免疫磁珠處理的菌液,每份檢體挑取50個菌落接種神奈川現象培養基,結果卻全部為陰性。這一結果充分說明免疫磁珠法對環境樣品中的帶有特定K型抗原的副溶血性弧菌起到了明顯的濃縮、收集作用。3tdh陽性副溶血性弧菌的檢測方法利用免疫磁珠分離技術可有效地收集、濃縮大量樣品中的少量病原微生物,免疫磁株法為難于從環境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問題提供了一種有效手段,也為研究TDH陽性副溶血性弧菌在環境中的分布及由其引起的食物中毒的預防提供了重要依據,該方法對于水和食品中致病微生物的快速分離和檢驗也有著重要的應