DNA雙鏈斷裂與同源重組修復的研究進展DNA雙鏈斷裂（DSB）是細胞受到電離輻射后最嚴重的DNA損傷，造成細胞凋亡、細胞周期阻滯以及DNA損傷修復。DNA損傷發生后，激活細胞內DNA損傷應答，啟動DSB修復通路同源重組（HR）和非同源重組末端連接（NHEJ）。HR修復分為聯會前期、聯會期和聯會后期，以姐妹染色單體為模板，進行無錯誤修復，是保護基因組完整性的重要機制。對IR造成的DSBHR和NHEJ含有互補關系，G2和S期HR是重要修復方式。HR是腫瘤發病風險、預后指標和治療靶點，合成致死是HR用于腫瘤靶向治療的重要機制。本文重要對DSB修復過程中所涉及HR修復通路中的分子機制、合成致死概念及其與NHEJ修復的關系作一綜述，并探討其成為轉化醫學研究和潛在臨床應用的可能性。標簽：DNA雙鏈斷裂；同源重組；非同源末端連接；合成致死；轉化醫學研究DNA雙鏈斷裂（DNAdoublestrandsbreakage，DSB）是細胞受到電離輻射后生物學上最嚴重的損傷。DNA損傷激活細胞內DNA損傷應答（DNAdamageresponse，DDR），產生細胞凋亡、細胞周期阻滯以及DNA損傷修復等一系列生物學效應。DSB修復有同源重組（Homologousrecombination，HR）和非同源重組末端連接（Non-homologousend-joining，NHEJ）修復兩種方式。本文著重介紹HR修復分子機制、影響因素、合成致死及其與NHEJ修復的關系，并探討其臨床應用的潛在可行性。DNA損傷啟動多個修復機制，其中HR修復是保護基因組完整性的重要機制，參加DNA單鏈斷裂（Singlestrandbreakage，SSB）造成的復制叉斷裂和鏈間交聯以及DSB的修復，以姐妹染色單體為DNA模板，是無錯誤修復通路，只發生在S期和G2期[1]。放射生物學家們從20世紀早期已著手HR修復與DSB的關系的研究，本文僅以時間點為線索回想HR修復和合成致死的重要研究進展，詳見圖1。1同源重組修復機制、影響因素及其合成致死效應HR修復的重要成分涉及MRN（MRE11–RAD50–NBS1）復合體，RAD51、RAD51同源異構體、RAD52（在酵母菌中）、RAD54，涉及BRCA1、CtIP（CtBPinteractingprotein）、ATM、ATR、PALB2（PartnerandlocalizerofBRCA2）、BRIP1（BRCA1interactingproteinC-terminalhelicase1）等因子[1-2]。1.1HR修復機制HR修復分為3個時期：（1）聯會前期；（2）聯會期；（3）聯會后期[1-3]。1.1.1聯會前期MRN復合體與DNA斷端結合啟動HR修復，Mre11與CtIP啟動5’-3’切除過程[4]。核酸外切酶1和含有解螺旋酶-核酸內切酶功效的STR-Dna2復合體共同作用持續產生ssDNA。RPA覆蓋切除的DNA斷端，限制二級構造形成，增進RAD52介導的重組酶RAD51裝載。RAD51在ssDNA上形成前聯會核蛋白纖維[1，3]。1.1.2聯會期RAD51-ssDNA聯會前核蛋白纖維介導同源序列的尋找和DNA鏈侵入，這是HR修復核心反映。靶DNA與RAD51核蛋白纖維之間的DNA鏈配對形成D-loop，涉及新異源雙鏈DNA和供體DNA移位的鏈[3]。RAD54協助RAD51尋找DNA同源序列、Holliday聯結分支的遷移及RAD51取代侵入DNA和啟動DNA修復的過程[5]。1.1.3聯會后期以3’-斷端為引物進行DNA合成，RAD51與dsDNA分離，暴露DNA合成所需的3’-OH[1]。第二個DSB斷端與擴展的D-loop平行，形成雙Holliday聯結，在解離酶作用下這些對稱構造產生交換型或非交換型產物[3]。1.2HR修復的影響因素HR修復受RAD51、BRCA1、BRCA2等因子調控。BRCA1的腫瘤克制因子活性依賴其細胞周期檢查點、轉錄、蛋白泛素化、凋亡和DNA修復方面的功效，受BRCT磷酸蛋白識別區域調節。Rad50、RAD51和γH2AX的募集過程依賴BRCA1，BRCA1缺失細胞喪失使RAD51集中于DNA損傷區域的能力，造成HR和NHEJ修復、S期和G2-M期細胞周期檢查點均存在缺點[5-6]。間質-上皮轉型（Mesenchymalepithelialtransition，MET）克制劑下調MET活性，減少RAD51移入細胞核并阻斷RAD51-BRCA2復合體之間互相作用，致HR修復受損，γH2AX消退延遲，細胞內DSB持續高水平[7]。CDK1、2（Cyclindependentkinase1，2）磷酸化BRCA2，調節其與RAD51互相作用，增進S/G2期HR修復[8]。總之，HR修復是眾多因子共同作用互相協調的過程，這些因子失活或環節中斷都會對HR修復的最后效應產生影響。1.3合成致死合成致死（Syntheticlethality）指2個或以上基因同時突變的遺傳組合造成細胞死亡，而這些基因中任意一種基因突變都不會引發細胞死亡。HR修復缺點腫瘤細胞中常見BRCA1和BRCA2等基因突變，此背景下應用特異性靶向藥品克制特定基因體現，產生合成致死效應。其治療方略意義是在DNA損傷修復缺點腫瘤細胞中克制其它修復通路增進合成致死效應；也可克制預先存在細胞周期檢查點缺點或修復缺點細胞的細胞周期檢查點，增加損傷DNA聚集和增進細胞死亡[9]。2HR修復與NHEJ修復的關系對IR所致的DSBHR與NHEJ修復含有互補作用。一種決定修復方式的重要因素是5’-3’DNA斷端切除，啟動NHEJ修復失敗后進行，增進HR修復而非典型NHEJ修復。53BP1阻斷斷端切除克制HR修復，是核心調節因子[10]。DDR因子E3泛素連接酶RNF168增進刪除BRCA1的細胞中H2A/H2AX在K13/15單泛素化和53BP1聚集在損傷區域，克制HR修復[11]。HR修復缺點細胞中，易產生錯誤的NHEJ修復是重要修復方式，染色體易位和重組的頻率增加。G2期兩條通路都有效時，優先選擇不易產生錯誤的HR修復[12]。3HR修復研究的潛在臨床意義DSB修復異常作為腫瘤發病風險、預后指標和治療靶點，近年來受到廣泛關注和研究。3.1HR修復與疾病發生和預后的關系BRCA1N端RING構造域和C端BRCT構造域的遺傳性變異對易造成遺傳性乳腺癌和卵巢癌[13]。BRCA1特定位點錯義突變或氨基酸置換影響HR修復和SSA（single-strandannealing）修復，是遺傳性乳腺癌致病因素[14]。BRCA1與50%～85%乳腺癌和15%～45%卵巢癌發病風險有關。BRCA2是啟動BRCA1-BRCA2-HR損傷修復的效應器，其遺傳性缺點與40%～60%乳腺癌和10%～20%卵巢癌終身風險有關[15]。部分HR修復通路因子如PALB、BRIP1、BARD1、MUS81、RAD51等，有克制腫瘤活性的功效，在克制乳腺癌和卵巢癌發病中起重要作用[16]。RAD51低體現見于乳腺癌，高體現見于胰腺癌。MRE11（T）11重復序列突變見于80%以上結直腸癌患者中[2]。RAD51家族組員XRCC2缺點時細胞內HR修復減少100倍，XRCC2rs3218408與乳腺癌患病風險有關，rs3218536與乳腺癌和胰腺癌不良預后有關[17]。非小細胞肺癌中RAD51G135C可作為預測臨床效果的生物指標，攜帶C等位基因患者中位生存率更高；且在吸煙和既往吸煙患者中，攜帶C等位基因患者總生存率較GG基因型患者高[18]。3.2HR修復與腫瘤靶向治療的研究進展3.2.1合成致死的臨床應用HR修復應用于腫瘤靶向治療的一種重要機制是合成致死，常見方略有2種：（1）以特定DNA修復通路為靶點；（2）細胞周期檢查點克制劑。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶[Poly（adenosinediphosphate（ADP）-ribose）polymerase，PARP]克制劑是重要的合成致死靶向藥品。PARP在修復SSB中的作用是合成致死的基礎。復制叉碰到SSB，該損傷轉換為DSB，NHEJ不能修復這類只有一種斷端的DSB，需啟動HR修復；若HR缺點，則無法修復。PARP克制劑（PARPinhibitor，PARPi）增加開放型SSB，致復制有關DSB數量增加，最后引發染色單體斷裂和細胞死亡[9]。BRCA變異細胞對PARPi敏感性是野生型細胞的1000倍，PARPi奧拉帕尼治療乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌顯示出明顯療效[5]。但50%上皮性卵巢癌HR修復完整，限制PARPi的應用。17-AAG將HR修復完整腫瘤轉變為HR修復缺點腫瘤，增加上皮性卵巢癌細胞對奧拉帕尼的敏感性[19]。PARPiVeliparib在三陰乳腺癌和化療抗拒的卵巢癌前臨床實驗中顯示單藥活性[2]。Rad52增進Rad51介導的HR修復，BRCA1、PALB2、BRCA2缺點人腫瘤細胞中刪除RAD52HR修復速度減緩，染色體異常增加，克隆存活率減少，它們之間存在合成致死關系。以Rad52為靶點的藥品研發處在前臨床實驗階段[20]。應用細胞周期檢查點克制劑于DNA修復缺點細胞是另一種治療方略。抑癌基因p53為調控G1/S期檢查點所必需，多個腫瘤細胞中失活，特別是BRCA1或BRCA2突變腫瘤細胞中。ATM-ATR-CHK1通路參加DNA損傷后S和G2期檢查點調控，CHK1克制劑增加p53突變細胞對放射治療或化學治療敏感性[9]。3.2.2以HR修復通路因子為靶點的腫瘤治療HR修復通路重要因子作為腫瘤靶向治療的潛在靶點已被廣泛研究。近年來出現部分以HR修復為靶點的抗腫瘤新藥，如：（1）蛋白酶克制劑；（2）Bcl-abl克制劑伊馬替尼；（3）組蛋白乙酰化酶克制劑（Histonedeacetylaseinhibitors，HDACi）；（4）熱休克蛋白HSP90克制劑17-AAG。特異性克制劑變化或減少HR修復通路重要因子功效或活性，克制其修復能力以增加腫瘤細胞對造成DSB敏感性的目的，此種治療方略已見于前臨床實驗。地西他濱解決多發性骨髓細胞激活DDR，增進RAD51和53BP1形成，聯合RAD51克制劑B02增加其誘導的細胞凋亡；小劑量HDACiJNJ-26481585干擾DNA損傷修復通路，提高地西他濱介導的細胞毒性[21]。MRN克制劑Mirin制止G2/M期檢查點激活和HR修復[2]。ATM屬于PIKK超家族，G1-S期ATMS367，S1893，和S1981位點脫磷酸化下調ATM水平，克制HR修復[22]，其高度特異性小分子ATP競爭性克制劑KU-55933提高腫瘤細胞對放射線和致DSB藥品的敏感性，提示該藥的潛在臨床應用價值[2]。刪除特定基因克制HR修復，增加腫瘤細胞放射敏感性，這是含有應用前景的增加放射治療敏感性的靶點。研究顯示敲除IGF-1R致HR修復缺點，γH2AX消除延遲，G1期細胞放射敏感性增加[23]。黏連蛋白（Cohesin）由SMC1、SMC3和Rad21構成，磷酸化后激活，DSB形成時聚集并增進修復。敲除53BP1、H2AX和MDC基因后，SMC1、SMC3的磷酸化減少；敲除Rad21引發細胞周期分布變化，G1期細胞較S期、G2期、M期多[24]。總之，DSB是細胞受到電離輻射后發生的最嚴重DNA損傷，其修復機制復雜且與腫瘤發病和治療親密有關。近年來有關其修復機制研究始終是腫瘤轉化醫學研究的熱點，其中HR修復作為保護基因組完整性的重要機制受到越來越多的關注，重要集中于3個方面：（1）HR修復基因缺點與多個腫瘤發病有關，如何篩查攜帶這些突變基因的高危人群達成防止腫瘤的目的是腫瘤防止的難點，如何檢測腫瘤患者中這些突變基因以期制訂合理的治療方略；（2）通過克制腫瘤細胞HR修復通路特別是合成致死，增加腫瘤放化療敏感性，為腫瘤的靶向治療提出了一種新的思路；（3）DNA損傷修復涉及多個修復機制，進一步研究它們之間的聯系，增進其在腫瘤治療的應用研究。進一步理解DSB與HR修復之間的分子機制并將其應用于腫瘤個體化治療有望突破腫瘤治療成功的瓶頸。參考文獻[1]KrejciL，AltmannovaV，SpirekM，etal.Homologousrecombinationanditsregulation[J].NucleicAcidsRes，，40（13）：5795-5818.[2]CerbinskaiteA，MukhopadhyayA，PlummerER，etal.Defectivehomologousrecombinationinhumancancers[J].CancerTreatRev，，38（2）：89-100.[3]RenkawitzJ，LademannCA，JentschS.Mechanismsandprinciplesofhomologysearchduringrecombination[J].NatRevMolCellBiol，，15（6）：369-383.[4]MakharashviliN，TubbsAT，YangSH，etal.catalyticandnoncatalyticrolesoftheCtIPendonucleaseindouble-strandbreakendresection[J].MolCell，，23（2）：59-60.[5]LordCJ，AshworthA.MechanismsofresistancetotherapiestargetingBRCA-mutantcancers[J].NatMed，，19（11）：1381-1388.[6]ShakyaR，ReidLJ，ReczekCR，etal.BRCA1tumorsuppressiondependsonBRCTphosphoproteinbinding，butnotitsE3ligaseactivity[J].Science，，334（6055）：525-528.[7]MedovaM，AebersoldDM，ZimmerY.METinhibitionintumorcellsbyPHA665752impairshomologousrecombinationrepairofDNAdoublestrandbreaks[J].IntJCancer，，130（3）：728-734.[8]MalumbresM，BarbacidM.Cellcycle，CDKsandcancer：achangingparadigm[J].NatRevCancer，，9（3）：153-166.[9]GuoGS，ZhangFM，GaoRJ，etal.DNArepairandsyntheticlethality[J].IntJOralSci，，3（4）：176-179.[10]BuntingSF，NussenzweigA.End-joining，translocationsandcancer[J].NatRevCancer，，13（7）：443-454.[11]MunozMC，YanezDA，StarkJM.AnRNF168fragmentdefectiveforfocalaccumulationatDNAdamageisproficientforinhibitionofhomologousrecombinationinBRCA1deficientcells[J].NucleicAcidsRes，，25（16）：23-24.[12]BergsJW，KrawczykPM，BorovskiT，etal.Inhibitionofhomologousrecombinationbyhyperthermiashuntsearlydoublestrandbreakrepairtonon-homologousend-joining[J].DNARepair（Amst），，12（1）：38-45.[13]DeverSM，WhiteER，HartmanMC，etal.BRCA1-directed，enhancedandaberranthomologousrecombination：mechanismandpotentialtreatmentstrategies[J].CellCycle，，11（4）：687-694.[14]TowlerWI，ZhangJ，RansburghDJ，etal.AnalysisofBRCA1variantsindouble-strandbreakrepairbyhomologousrecombinationandsingle-strandannealing[J].HumMutat，，34（3）：439-445.[15]MaxwellKN，DomchekSM.CancertreatmentaccordingtoBRCA1andBRCA2mutations[J].NatRevClinOncol，，9（9）：520-528.[16]EversB，HelledayT，JonkersJ.Targetinghomologousrecombinationrepairdefectsincancer[J].TrendsPharmacolSci，，31（8）：372-380.[17]LinWY，CampNJ，Cannon-AlbrightLA，etal.AroleforXRCC2genepolymorphismsinbreastcancerriskandsurvival[J].JMedGenet，，48（7）：477-484.[18]NogueiraA，CatarinoR，CoelhoA，etal.InfluenceofDNArepairRAD51genevariantsinoverallsurvivalofnon-smallcelllungcancerpatientstreatedwithfirstlinechemotherapy[J].CancerChemotherPharmacol，，66（3）：501-506.[19]ChoiYE，BattelliC，WatsonJ，etal.Sublethalconcentrationsof17-AAGsuppresshomologousrecombinationDNArepairandenhancesensitivitytocarboplatinandolaparibinHRproficientovariancancercells[J].Oncotarget，，5（9）：267