生精小管發(fā)育過程中的體視學變化

生精小管和生精細胞在發(fā)育和衰老過程中的形態(tài)變化和功能差異一直是寄生蟲生物學的熱點之一。近來,國內(nèi)外學者已就衰老所致生精小管退化、大鼠性成熟前精子發(fā)生等諸多方面展開了研究,但從大鼠出生到衰老各發(fā)育階段,特別就衰老所致睪丸生精小管及其內(nèi)部生精細胞的變化尚缺乏深入而系統(tǒng)的研究。故本研究利用免疫細胞化學、凋亡細胞原位檢測、圖像分析等技術方法,研究了從大鼠出生到生后25月齡各發(fā)育階段生精小管的形態(tài)學變化及增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)、凋亡在生精小管的原位表達,以期闡明生精小管在發(fā)育、衰老過程中形態(tài)學的變化規(guī)律及生精細胞增殖、凋亡對其作用,為男性生殖生物學的基礎及臨床研究提供實驗依據(jù)。材料和方法1.動物的年齡選取選用雄性健康SD大鼠,分為出生組(生后8h內(nèi),平均體重5.6g),3周齡組(平均體重53.0g),3月齡組(平均體重390.0g),6月齡組(平均體重426.7g),10月齡組(平均體重521.7g),12月齡組(平均體重601.7g),除25月齡取3只,其他各組均取6只動物。取其左、右側睪丸分別固定于Bouin液、4%多聚甲醛(4℃)中,常規(guī)石蠟包埋,沿睪丸長軸垂直方向做連續(xù)切片,厚5μm,將其裱于涂有蛋白甘油的載片(用于HE染色)及3-氨丙基三已基硅烷的載片上(用于免疫細胞化學染色)。2.染色、復染、封片切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度酒精復水,蘇木精染色5min,經(jīng)1%鹽酸酒精分色,自來水沖洗藍化后,再用伊紅復染6min,最后經(jīng)梯度酒精脫水,二甲苯透明后封片。3.pcna抗體的制備切片脫蠟后用3%甲醇-過氧化氫液處理30min,經(jīng)山羊血清于37℃處理30min,加PCNA抗體(1∶50ZYMED)后置于4℃冰箱過夜,再加入生物素標記的二抗(SPTM試劑盒ZYMED)在37℃,30min后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素,孵育30min,DAB-H2O2顯色約5min,以上各步間均用PBS沖洗,陰性對照用PBS替代一抗。4.utp1sabc應用細胞凋亡原位檢測試劑盒(BoehringerMannheim公司)。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟入水,隨后浸入3%甲醇-過氧化氫液中,室溫孵育15min,蒸餾水洗3次,3min/次;標本片加TBS1∶100新鮮稀釋蛋白酶K37℃消化15min,蒸餾水洗;標本片加標記緩沖液20μl/片,甩掉后,再加TDT、DIG-d-UTP、LB的混合液,4℃冰箱過夜,TBS洗;每片加封閉液50μl,室溫30min,甩掉,加生物化抗地高辛抗體50μl/片于標本片上,37℃,60min,TBS沖洗;用TBS1∶100稀釋SABC后加至切片,37℃反應40min,TBS洗;經(jīng)DAB顯色、蘇木精輕度復染后脫水、透明、封片。5.管腔測量分析每只動物選取3張生精小管橫切面及生精細胞分布均勻的區(qū)域,利用北京航空航天大學病理圖像分析系統(tǒng)采集圖像,每個發(fā)育階段采集20個視野(HE染色),利用該系統(tǒng)的管腔測量分析模塊測量所選圖內(nèi)各個生精小管面積、管腔面積、管腔管壁面積比,用Excel作圖表,并進行單因素方差分析,雙樣本異方差分析t檢驗處理。結果1.生精小管的視覺研究1.1生精小管的平均面積從初生到生后3月齡生精小管面積迅速增大,并于生后3月齡達到峰值,之后生精小管平均面積緩慢減少(附表,圖1)。1.2月生后6作管腔面積的變化從初生到生后6月齡,管腔面積迅速增大,并于生后6月齡達到峰值,從生后6月齡到生后12月齡管腔面積緩慢減少,生后25月齡時生精小管內(nèi)未見管腔(附表,圖2)。1.3生精小管與生精小管之間的平均面積比從3周齡逐月上升,10月齡出現(xiàn)高峰,而后又明顯減小(附表,圖3)。2.睪丸的分離和分離初生組生精小管分布在睪丸周邊,橫截面較小,其內(nèi)有2～3個性原細胞,尚未出現(xiàn)管腔,支持細胞則分散在生精小管周邊,排列緊密(圖4,5);到生后3周,生精小管在睪丸內(nèi)分布均勻,但排列較松散,部分生精小管內(nèi)開始出現(xiàn)管腔;生后3月齡時生精小管管腔明顯,生精細胞在管內(nèi)緊密排列,可見精子生成(圖6)。生后6月齡時生精小管管徑較大,細胞層數(shù)較多。生后10月齡時精子數(shù)量少,生精細胞間開始出現(xiàn)空泡;生后12月齡,管腔內(nèi)仍可見精子;至生后25月齡,睪丸體積變小,表面粗糙呈顆粒狀,且嚴重皺縮、干癟。生精小管已無管腔,且生精細胞間空泡化較明顯,生精細胞數(shù)量減少,排列紊亂,部分生精小管內(nèi)僅可見支持細胞、精原細胞及精子性多核吞噬性巨細胞(圖7)。3.pcna精原細胞表達情況PCNA免疫反應陽性細胞的顆粒為棕色,分布于核內(nèi),陰性對照組未見陽性顆粒。初生組有少量性原細胞呈陽性表達。生后3周齡組PCNA精原細胞及精母細胞呈強陽性表達(圖8);生后3月齡精原細胞和精母細胞仍呈陽性表達,到生后10月時,僅可見部分精原細胞呈陽性反應,且分布不均勻,大部分初級精母細胞呈弱陽性反應;生后12月齡仍可見陽性的精原細胞和初級精母細胞,到生后25月齡陽性的精原細胞和初級精母細胞僅分布于部分生精小管。4.生精細胞凋亡初生組生精小管內(nèi)性原細胞的陽性表達較弱,為淺棕色(圖9);生后3周齡時,各類生精細胞為陽性表達,廣泛分布于各個生精小管內(nèi)(圖10);生后3月齡,各級生精細胞均有凋亡現(xiàn)象,陽性的精原細胞、精母細胞比較多見;到生后12月齡凋亡的生精細胞數(shù)目減少;生后25月齡,呈陽性表達的生精細胞再度增多,為弱陽性淺染,生精小管內(nèi)可見陽性的多核巨細胞(圖11)。討論1.生精小管腔的出現(xiàn)生精小管平均面積從出生到生后3月齡迅速增大,并于生后3月齡達到最大值,這與3月齡大鼠到了性成熟期,生精小管內(nèi)細胞種類及數(shù)量增多相關,即生精小管平均面積迅速增大與生后3周齡生精細胞旺盛的增殖能力有關,而3周到3月這一階段生精細胞數(shù)量的劇烈增多,是生精小管平均面積迅速增大的重要原因之一。生精小管又是睪丸重要組成部分,生精小管細胞數(shù)量增多,面積增大,可導致睪丸重量增加,Van亦有類似報道,他發(fā)現(xiàn)大鼠睪丸重量在生后25d時急劇增加,為精子生成奠定物質(zhì)基礎。我們在研究中發(fā)現(xiàn)出生時生精小管分布于睪丸周邊,睪丸中間無生精小管,接著在生后3周的睪丸內(nèi),靠近睪丸白膜的生精小管發(fā)育較早,這似與周邊血液供應豐富,可以得到充分的營養(yǎng)及激素等信號刺激有關,要得到最終的結論尚待進一步研究。生精小管管腔的出現(xiàn)與精子生成、運輸有關,但在不同物種內(nèi)生精小管管腔出現(xiàn)的時間并不相同,如Djungarian倉鼠生精小管管腔的形成是在生后15d,大鼠生精小管管腔的形成是在生后第17d,而中國倉鼠生精小管管腔的形成約在生后28～31d。本研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠在生后21d生精小管管腔開始出現(xiàn),同時凋亡細胞原位檢測分析表明:在生后21d時,生精細胞的凋亡出現(xiàn)峰值,生精細胞的大量凋亡應是生精小管管腔出現(xiàn)的重要原因之一。此外,生精上皮基膜擴大的速率遠遠大于生精細胞的增殖水平也是生精小管管腔出現(xiàn)的原因之一。2.老齡化致生精皮質(zhì)變化的原因在衰老過程中,肉眼觀可發(fā)現(xiàn)隨衰老睪丸質(zhì)地松軟,沒有成年組睪丸那樣飽滿和凸出感。特別是到生后25月齡,睪丸的體積變小,表面粗糙呈顆粒狀。組織學觀察發(fā)現(xiàn)衰老大鼠睪丸的纖維化程度較嚴重,而纖維化應該是睪丸表面呈顆粒狀外觀原因之一。此外,在研究中我們發(fā)現(xiàn)睪丸組織的隨齡變化是不均一的,這表現(xiàn)在生精細胞的層次、PCNA陽性細胞及凋亡細胞在同一發(fā)育階段不同生精小管內(nèi)的分布均有所不同,這與不同生精小管所處的微環(huán)境及生精細胞所處生精上皮的時相不同有關。衰老所致生精上皮發(fā)生劇烈變化的原因尚不清楚,據(jù)估計,該種變化似與衰老動物的血睪屏障受累等因素有關。因為在25月齡的衰老大鼠中,睪酮水平隨有下降,但是該水平足以維持在正常成年動物的精子發(fā)生。同時有文獻報道,在BrownNorwayRat這一衰老動物模型中,循環(huán)血流中的FSH水平尚未降低,因此,生精上皮退化并不是生精上皮缺乏激素的維持,Richardson等提出增厚的生精小管基膜引起進入和排出生精上皮物質(zhì)的降低,于是導致了生精細胞的退化,我們在實驗中也發(fā)現(xiàn)隨衰老的進程生精小管基膜有增厚的趨勢,在本研究中我們認為生精小管基膜的增厚與睪丸衰老有關,對此要做進一步結論應進行深入地研究。3.生精細胞