吳茱萸一測多評的含量測定

吳茱萸是廣州科的一種植物，屬于吳茱萸和石虎。這是一種重要的流行性疾病。我是singa。稍微多地出汗。血液。香蒲（jus.）一直很成熟。它具有加熱和散寒、稀釋肝臟和緩解疼痛的功效。它經(jīng)常用于治療腹部寒冷疼痛、嘔吐、腹瀉、頭痛、胃痛、腹痛、疝痛、腹痛和痛經(jīng)。生物堿是吳茱萸藥材中的有效成分,現(xiàn)行版的《中國藥典》也以吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量總和作為質(zhì)量控制指標(biāo)。但是,上述2個(gè)成分在吳茱萸藥材中含量很低,并且研究發(fā)現(xiàn)這類成分在臨床用藥的水煎過程中煎出率很低(約10%)。而吳茱萸內(nèi)酯等檸檬苦素類物質(zhì)是吳茱萸中除生物堿之外的另一大類有效成分,研究表明吳茱萸內(nèi)酯有很強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等活性,并且在吳茱萸藥材中的含量明顯高于吳茱萸堿和吳茱萸次堿,文獻(xiàn)報(bào)道,吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸次堿和吳茱萸堿三者總含量可達(dá)到1%以上,因此筆者認(rèn)為增加吳茱萸內(nèi)酯作為吳茱萸質(zhì)量控制指標(biāo)更具合理性。目前已有用多個(gè)成分同步測定來控制吳茱萸質(zhì)量的研究報(bào)道,但是對照品供應(yīng)嚴(yán)重不足限制了該方法在實(shí)際的科研、生產(chǎn)和市場監(jiān)督中的應(yīng)用。針對這種現(xiàn)狀,提出應(yīng)用“一測多評”法(QAMS)開展吳茱萸多指標(biāo)質(zhì)量控制的研究設(shè)想。即只測定其中1個(gè)成分(吳茱萸次堿),通過建立該成分與其他有效成分(吳茱萸堿、吳茱萸內(nèi)酯)間的相對校正因子,計(jì)算出其他成分的含量,實(shí)現(xiàn)多成分的同步測定。關(guān)于“一測多評”的研究思路已在木通、人參等藥材得到驗(yàn)證,筆者分別建立了皂苷、生物堿等同類成分間的相對校正因子。本文建立了不同類成分之間的相對校正因子,重點(diǎn)探討“一測多評”法在不同類成分之間應(yīng)用的可行性與適應(yīng)性。1儀器、試劑和儀器Waters2695-2996高效液相色譜系統(tǒng),Empower2工作站;HP1100高效液相色譜系統(tǒng),HP化學(xué)工作站)。AE240電子分析天平(METTLER)。KQ-100型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。乙腈為色譜純(Fisher公司);水為娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。吳茱萸藥材購自湖南、貴州、廣西等省,經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生藥室何希榮主管藥師鑒定,均為藥典收載的品種。吳茱萸內(nèi)酯(批號110800-200404),吳茱萸堿(批號110802-200505),吳茱萸次堿(批號110802-200505)購于中國藥品生物制品檢定所。2方法和結(jié)果2.1測定指標(biāo)質(zhì)量在一定的范圍內(nèi)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比,即W=fA。在吳茱萸的多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)時(shí),以吳茱萸次堿為參照物,建立吳茱萸次堿堿與其他成分(吳茱萸堿、吳茱萸內(nèi)酯)之間的相對校正因子;在實(shí)際測定時(shí),用外標(biāo)法測定吳茱萸次堿,再通過校正因子計(jì)算吳茱萸和吳茱萸內(nèi)酯含量。同時(shí)用常規(guī)方法進(jìn)行同步測定,以驗(yàn)證計(jì)算值的正確性和可行性。2.21個(gè)研究和多評價(jià)理論的研究2.2.1組分分離度試驗(yàn)℃;流速1.0mL·min-1。檢測波長225nm;理論塔板數(shù)以吳茱萸堿計(jì)不低于3000,上述色譜條件下,各組分分離度良好。對照品與樣品色譜圖見圖1。2.2.2對照品溶液的制備精密稱取吳茱萸內(nèi)酯4.8mg,吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品各0.70mg,置2mL量瓶中,用甲醇溶解稀釋至刻度,并保存于4℃冰箱中,備用。2.2.3微生物濾膜制備取吳茱萸粉末(過40目篩)約0.5g,精密稱定,置50mL三角瓶中,精密加入80%乙醇溶液25mL,稱重,冷浸1h,超聲40min,稱重補(bǔ)失,搖勻,過0.22μm微孔濾膜,棄去初濾液,取續(xù)濾液備用。2.2.4吳新型斜波/收波長吳茱萸堿最大吸收波長在225nm,且230nm后吸收曲線陡降;吳茱萸次堿最大吸收波長在343nm,在220~240nm為強(qiáng)吸收肩峰;吳茱萸內(nèi)酯的最大吸收波長為192nm,在225nm有較強(qiáng)的吸收。因此,要同時(shí)測定三者,以選擇225nm為佳。吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿,吳茱萸次堿在190~400nm進(jìn)行全波長掃描。見圖2。2.2.5吳兩種植物氨基網(wǎng)絡(luò)g結(jié)果精密吸取吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣10μL,測定峰面積積分值。以峰面積積分值對進(jìn)樣量進(jìn)行回歸處理,結(jié)果表明吳茱萸內(nèi)酯在0.375~24.0μg呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=1.48×105X+1.22×104(r=0.9999);吳茱萸堿在0.0547~3.50μg呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=1.08×107X-4.47×105(r=0.9999);吳茱萸次堿在0.0547~3.50μg呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=5.83×106X-5.07×103(r=0.9999)。2.2.6吳兩種堿峰面積rsd取貴州1#供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10μL,結(jié)果吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積RSD分別為0.50%,0.57%和0.38%。儀器及進(jìn)樣精密度良好。2.2.7吳兩種堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)取河南3#樣品約0.5g,共6份,精密稱定,按2.2.3項(xiàng)下制備供試品溶液并測定,6份樣品中吳茱萸內(nèi)酯的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.06%,RSD1.3%,吳茱萸堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.180%,RSD1.4%,吳茱萸次堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.133%,RSD0.78%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。2.2.8吳基層弱堿峰面積研究取同一供試品溶液,分別在0,2,4,8,24h進(jìn)樣分析,每次進(jìn)樣10μL,記錄峰面積,吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為2.3%,1.1%和2.3%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.2.9加樣回收回收率的測定精密稱取河南3#樣品共18份,每份約0.25g,隨機(jī)選取其中6份樣品精密加入含0.106g·L-1吳茱萸內(nèi)酯的80%乙醇溶液25mL,隨機(jī)選取另6份樣品精密加入含0.0180g·L-1吳茱萸堿的80%乙醇溶液25mL,剩余6份樣品中精密加入含0.0133g·L-1吳茱萸次堿的80%乙醇溶液25mL,按供試品溶液制備方法操作,計(jì)算各成分的加樣回收率,結(jié)果見表1。2.2.1相對校正因子在一定的范圍內(nèi)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比,即W=fA。在吳茱萸的多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)時(shí),以藥材中的吳茱萸次堿為內(nèi)參物,建立吳茱萸次堿(rutacarpine,RU)與吳茱萸內(nèi)酯(evodin,ED)、吳茱萸堿(evodiamine,EV)之間的相對校正因子。相對校正因子的定義如下:fsm=fsfm=Ws×AmWm×Asfsm=fsfm=Ws×AmWm×As公式(1)As,Am分別為內(nèi)參物s和其他成分m的峰面積,Ws,Wm分別為內(nèi)參物s和其他成分m的量。根據(jù)公式(1)求出吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿相對于吳茱萸次堿的相對校正因子如下:fRU/ED=0.02534,fRU/EV=1.8492.3吳兩種保水性的含量按供試品溶液處理方法制備了11批吳茱萸樣品,分別精密吸取供試品溶液各10μL注入高效液相色譜儀,測定。采用外標(biāo)法和“一測多評”法分別計(jì)算吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸內(nèi)酯含量,結(jié)果見表2。從其含量間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來看,在4%以內(nèi);表明兩種含量測定方法得到的含量值之間差異不大,說明在吳茱萸的生物堿和內(nèi)酯間應(yīng)用“一測多評”法進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)是可行的。2.4修正因素的重復(fù)回歸2.4.1兩種堿的相對校正因子取2.2.2項(xiàng)下系列混合對照品溶液,進(jìn)樣10μL測定,按2.2.10項(xiàng)下計(jì)算吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿相對于吳茱萸次堿的相對校正因子。考察了Waters2695-2996、HP11002種高效液相色譜系統(tǒng)和EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm),KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)2種色譜柱,結(jié)果見表3。2.4.2目標(biāo)峰的定位與紫外吸收特性的關(guān)系利用待測組分與內(nèi)參物保留時(shí)間的比值(相對保留值)定位,已知內(nèi)參物的保留時(shí)間,根據(jù)相對保留值(RT),結(jié)合紫外吸收特征,即能夠判斷出目標(biāo)峰的位置。結(jié)果見表4。3討論3.1證明可行性檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)研究建立了吳茱萸藥材中不同類成分的“一測多評”測定法并證明其可行性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以吳茱萸次堿為內(nèi)參物,采用相對校正因子計(jì)算樣品中其他兩種成分的含量與實(shí)測結(jié)果誤差最小,而以吳茱萸內(nèi)酯或吳茱萸堿為內(nèi)參物計(jì)算其他兩種成分含量與實(shí)測結(jié)果誤差大于5%。3.2柱溫設(shè)定對測定結(jié)果的影響采用相同溶劑系統(tǒng),考察比例的微小變化(乙腈-水-四氫呋喃-冰醋酸40.5∶58.5∶1∶0.2),檢測波長的微小變化(224nm),柱溫設(shè)定與否(30℃與室溫),對QAMS法測定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響,結(jié)果計(jì)算值與實(shí)測值相比,RSD>5%。推測原因是上述微小變化可導(dǎo)致保留時(shí)間不一致,并引起峰面積顯著變化,導(dǎo)致原相對校正因子變化大,影響準(zhǔn)確性。3.3%乙醇的提取考察了50%,70%,100%甲醇和50%,80%,95%乙醇6種溶液對吳茱萸中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿提取效率的影響,結(jié)果表明以80%乙醇提取,3種成分提取效率均為最高。以80%乙醇做溶劑,比較超聲和回流提取方法對提取結(jié)果的影響,結(jié)果差異不明顯。以80%乙醇做溶劑,分別超聲30,40,50min,結(jié)果40,50min均較30min提取完全,但40,50min差異較小。故確定以80%乙醇超聲提取40min,考察了加25,50,100mL80%乙醇的提取效率,結(jié)果三者沒有明顯差別,故確定以25mL80%乙醇超聲40min;浸泡30min和1h后超聲提取40min,結(jié)果浸泡1h的峰面積明顯高于浸泡30min,故確定以25mL80%乙醇,浸泡1h后超聲40min。3.4酸及其不同比例洗脫系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-冰醋酸、乙腈-水-四氫呋喃-冰醋酸及其不同比例洗脫系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水-四氫呋喃-冰醋酸(41∶59∶1∶0.2)的分離效果最好且達(dá)到基線分離。流動相中加入冰醋酸,可以改善分離效果,防止拖尾,使峰形尖銳、對稱,加入四氫呋喃增加了流動相對樣品的溶解性。3.5測定結(jié)果的討論含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),同一批樣品中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿3種成分的含量差異很大,吳茱萸內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在1.0%~47%,吳茱萸堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在0.05%~1.4%,吳茱萸次堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在0.06%~1.0%。吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿3種成分的含量差異很大,吳茱萸內(nèi)酯的含量分別為吳茱萸堿的3至24倍;為吳茱萸次堿的4至29倍。而吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量差異較小,通常前者含量是后者的1至2.5倍。吳茱萸中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量之和