細胞衰老過程中dna甲基化及甲基轉移酶dnm1表達的改變

細胞衰老是一種不可逆轉的生長停滯，是人類衰老和年齡疾病的基本原因。體外培養的正常人成纖維細胞具有限定的增殖潛力，經過連續傳代后逐漸變得衰老，即為細胞復制性衰老。此外，多種應激因素可以誘導細胞衰老的發生，過氧化氫(hydrogenperoxide,H2O2)最常用于獲得短時期內氧化應激誘導的細胞早衰。目前，衰老細胞的一些生物學特征，如端粒縮短、形態學改變、衰老相關β-半乳糖苷酶表達等已得到很好的闡述，然而，誘導細胞進入永久停滯狀態的內在分子機制仍不清楚。基因組DNA甲基化狀況是基因表觀遺傳微環境的基礎之一，在細胞衰老的過程中，基因組DNA甲基化的變化具有其特定的規律。研究表明，特定基因調控位點甲基化的累積作用于細胞衰老，基因組DNA的甲基化狀態影響細胞衰老過程中基因表達，染色質組裝等。DNA甲基轉移酶1(DNAmethyltransferase1,DNMT1)參與維持基因組DNA的甲基化狀態。本研究以人胚肺成纖維細胞為研究對象，對比細胞復制性衰老及過氧化氫誘導的早衰過程中基因組DNA甲基化水平的變化，同時檢測DNMT1的mRNA和蛋白表達變化，觀察兩種衰老過程中基因組DNA甲基化水平及DNMT1表達的差異。1材料和方法1.1材料表面人胚肺成纖維細胞(16PDL)購自中國醫學科學院基礎醫學研究所;細胞受試物為質量濃度30%H2O2(M/V)購自英國BDH公司。1.2細胞復制性衰老人胚肺成纖維細胞用含體積分數為10%的新生小牛血清L-DMEM低糖培養基常規培養，詳見文獻。以公式n=3.32(logN2-logN1)+X計算群體倍增水平(populationdoublinglevels,PDL)，n為繼代培養最終PDL,N2為該代細胞收獲細胞數，N1為上代接種細胞數，X為上代細胞PDL。本實驗在細胞復制性衰老過程中，正常人胚肺成纖維細胞分為22PDL(年輕細胞組)，35PDL(中年細胞組)，49PDL(復制性衰老細胞組)。同步培養22PDL正常人胚肺成纖維細胞約50%融合度時進行400μmol/LH2O2處理，每天用H2O2染毒工作液染毒1次，每次2h，共持續4d。經H2O2染毒4次后，繼續培養7d，進入明顯早衰持續狀態，分為早衰起始組(prematuresenescenceinitiationgroup,PSi，染毒4次后)和早衰持續組(prematuresenescencepersistencegroup,PSp，繼續培養7d)。1.35脈沖指數檢測應用5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)抗體結合甲基化的DNA，原位檢測DNA甲基化情況。去除培養基，1×磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersolution,PBS)清洗1次;4%多聚甲醛常溫固定細胞至少15min;去離子水清洗3次，每次5min;冷甲醇固定5min;去離子水清洗1次5min;2NHCl于37℃孵育30min;去離子水清洗1次5min;1×TBE緩沖液室溫孵育5min;去離子水清洗1次5min;1×PBS清洗1次5min;37℃于Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)含牛血清白蛋白(BSA,1%)中孵育30min;用PBST-BSA(含1%)稀釋一抗，于37℃孵育1h;PBST清洗3次，每次5min;加入PBST稀釋的二抗、異硫氫酸熒光素(fluoresceineisothiocyanate,FITC)標記，于37℃孵育30min;PBST清洗3次，每次5min;于0.2mg/ml熒光染料DAPI中染色2min;PBS清洗3次，每次5min;用抗熒光萃滅劑(FluoAntifadingMediumⅡ)封片，于熒光顯微鏡下觀察。于50μlEp反應管中加入2μl(0.2μg)樣品DNA,4USssI甲基化酶，1.5μmol/L未標記的SAM和SssI反應液，補水至25μl總體系，37℃孵育4h;同步，于50μlEp管中加入2μl(0.2μg)樣品DNA,8U甲基酶Dam,1.5μmol/L3H-S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)，1.5μmol/L未標記的SAM和Dam反應液，補水至25μl,37℃孵育4h;上述混合物分別于80℃溫育20min終止反應;將反應混合液加入Millipore96孔板中，每孔中加入0.3ml5%三氯乙酸和0.3ml70%乙醇真空抽吸3次，洗去未結合DNA的3H-SAM。取出板的底座，每孔加入固體閃爍液100μl，在microbeta液閃儀器上檢測每個孔對應的脈沖指數(centsperminute,CPM)值。根據公式%甲基CpG=(1-SssI/3.2dam比值)×100來計算基因組甲基化程度。1.5dnmt1的性能變化1.5.1熒光定量pcr和反轉錄合成dna應用Trizol試劑(Invitrogen)提取細胞總RNA,MMVReverseTranscriptionKit(Fermentas)反轉錄合成cDNA，熒光定量PCR采用SYBRue5f8PremixExTaqTM(PerfectRealTime)(TaKaRa)試劑。DNMT1上游引物5′-CCCCTGAGC-CCTACCGAAT-3′，下游引物5′-CTCGCTGGAGTG-GACTTGTG-3′;內參ACTB上游引物5′-TGAC-CCAGATCATGTTTGAG-3′，下游引物5′-ATCTCTT-GCTCGAAGTCCAG-3′。1.5.2westernblot檢測細胞蛋白表達水平采用RIPA裂解液(50mmol/LTris-HCl,pH=7.5,150mmol/LNaCl,1%NonidetP40,0.5%sodiumdeoxycholate,0.1%SDS)提取細胞總蛋白，一抗DNMT1(rabbit,Sigma)，GAPDH(sc-32233,SantaCruz)，二抗goatanti-rabbitIgG-HRP(sc-2031,SantaCruz)，goatanti-mouseIgG-HRP(sc-2005,SantaCruz)，進行WesternBlot檢測蛋白表達水平變化。1.6兩組本間的比較數據用x珋±s表示，采用Student’st-test檢驗進行兩樣本之間的比較，用SPSS13.0統計軟件進行分析，檢驗水準為α=0.05.2結果2.15不同年齡處理的基因組dna甲基化水平利用5-甲基胞嘧啶抗體進行細胞免疫熒光檢測，觀察甲基化DNA的定位及進行各組之間平均熒光強度變化趨勢的比較，從而檢測基因組DNA甲基化的變化趨勢。如圖1所示，在細胞復制性衰老過程中，年輕細胞組平均熒光強度為56.7，中年細胞組有所降低為41.5，而復制性衰老細胞組降低明顯為20.3,5-mC免疫熒光強度隨增齡逐漸降低;早衰組細胞也呈現相同的變化趨勢，早衰起始組為48.6，而早衰持續組為23.1。因此，與年輕細胞相比，衰老的細胞具有較低的基因組DNA甲基化水平。利用液閃計數的原理，檢測基因組DNA的總體5-mC內容物含量，從而確定基因組DNA的甲基化水平的改變，摻入[3H]甲基SAM的量越多，表明基因組DNA的甲基化水平越低。計算甲基化的CpG島含量，以百分比表示，結果如圖2所示，精子DNA作為陰性對照，甲基化CpG島的含量為5.0%，完全甲基化DNA作為陽性對照，含量為95.0%。在細胞復制性衰老過程中，年輕細胞組含量為68.2%，中年細胞組有所降低，為41.9%，復制性衰老細胞組最低為16.1%，甲基化CpG島的含量呈下降趨勢;對于處理組細胞，早衰起始組為63.5%，早衰持續組為18.0%，在細胞持續衰老的過程中，甲基化CpG島的含量也呈現明顯的下降趨勢。[3H]甲基摻入實驗表明，與年輕細胞相比，衰老的細胞具有較低水平的基因組DNA甲基化CpG島含量。2.3dmnt1抗體對mna表達的影響通過RT-Q-PCR檢測各組細胞甲基化相關酶的mRNA相對表達水平，如圖3所示，在細胞復制性衰老過程中，DNMT1的mRNA相對表達水平以22PDL年輕細胞組的表達量為對照，設為1，其余各組的表達水平與之相比較，中年細胞組無明顯改變，復制性衰老細胞組降低75%，H2O2處理后，早衰起始組表達升高至1.84倍，而早衰持續組降低80%。應用DNMT1抗體進行蛋白印跡，其蛋白表達與mRNA表達具有相同的變化趨勢(圖4)。因此，在細胞復制性衰老過程中，與年輕細胞相比，復制性衰老細胞組DNMT1明顯降低，對于H2O2誘導的細胞早衰過程中，DNMT1表達呈下降趨勢，早衰組DNMT1的表達水平同復制性衰老組。3細胞復制性衰老及葉片dna甲基化水平變化基因組DNA的甲基化狀態是表觀遺傳調控模式的重要方面。DNA甲基化的升高和降低與衰老過程相聯系，甲基化的改變經常以年齡相關的模式發生。在一些組織中，衰老細胞中甲基化的胞嘧啶水平降低，這種去甲基化狀態可以啟動染色體的不平衡和重排，從而增加一些年齡相關疾病的風險。本研究通過5-甲基胞嘧啶免疫熒光實驗、[3H]甲基摻入實驗分別定性和定量檢測細胞衰老過程中基因組DNA甲基化水平的變化情況。在人胚肺成纖維細胞復制性衰老過程中，基因組DNA甲基化整體趨勢逐漸下降，復制性衰老細胞組整體DNA甲基化水平最低;同樣，在H2O2誘導的細胞早衰過程中，基因組整體甲基化趨勢也是逐漸降低，早衰持續組基因組DNA甲基化水平最低，因此，基因組DNA甲基化水平的降低不僅與年齡有關，而且還受氧化應激的影響，基因組DNA低甲基化狀態是衰老細胞的伴隨特征;基因組DNA的低甲基化與年齡、氧化應激都有一定的關聯，而對甲基化水平的最終決定作用，取決于兩種因素作用于細胞的力量對比。然而，造成基因組DNA甲基化水平隨年齡改變的機制仍不清楚，DNMT1隨年齡表達降低，其可能作用于甲基化胞嘧啶內容物的整體降低。有研究報道，應用8-OH-鳥嘌呤取代鳥嘌呤，發現鄰近胞嘧啶的甲基化顯著改變，這一改變具有高度的位置特異性，氧自由基一定程度上改變所觀察的甲基化狀態。氧化劑能夠改變細胞內谷胱甘肽的水平，通過降低SAM的可利用度而影響DNA甲基化，而且也可以削弱細胞內甲基轉移酶對靶胞嘧啶甲基化的能力;單一的5-甲基胞嘧啶氧化成5-羥甲基胞嘧啶，能顯著抑制甲基化結合蛋白(Methy1-BindingDomainProtein,MBD)與寡核苷酸復合體的結合，從而降低結合能力。本研究又從甲基轉移酶的表達變化尋求基因組DNA甲基化水平改變的原因，在細胞復制性衰老過程中，DNMT1表達隨增齡呈下降趨勢。在WI-38成纖維細胞衰老過程中，DNMT1的mRNA表達水平降低，與本實驗部分結果一致。對于早衰起始組，H2O2處理4d之后，DNMT1表達升高，而隨著早衰程度的加