一測多評法測定柴胡藥材中柴胡皂苷a、c、d的含量

中醫的質量評價和質量控制是制約中醫藥現代化和國際發展的中心問題之一。它也是中醫研究的難點和熱點。然而,由于中藥本身的復雜性,現行以單一活性成分或指標成分定性定量分析為核心的質量控制模式,已不能適應全面控制中藥質量的要求,多指標綜合質量控制模式已成為中藥質量評價和控制的發展趨勢。由于多指標質量控制模式需要足夠量的化學對照品,而中藥化學對照品分離難度大,有些單體結構不穩定難以分離或分離成本過高等因素,致使中藥多指標成分質量控制僅限于科研,在實際生產應用中很難推廣。王智民等利用中藥有效成分內在函數和比例關系,提出了“一測多評”的想法,即只測定1個成分(對照品易得者),來實現對多個成分(對照品沒有或難以供應)的同步監控,并已成功運用于木通3種有效成分及人參與三七藥材中多種人參皂苷含量的同步測定。中藥柴胡為傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(Bupleurum)植物,柴胡BupleurumchinenseDC.(北柴胡)及狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.(南柴胡)的干燥根,是一味療效顯著的常用中藥,其主要活性成分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及柴胡皂苷c,目前柴胡的質量評價主要以這3種成分作為指標。由于柴胡皂苷結構復雜,在酸性條件下不穩定等,其對照品制備難度非常大,致使柴胡藥材及制劑的質量難以準確控制。本文以柴胡皂苷a(SSa)作為對照品,建立柴胡皂苷a與柴胡皂苷d(SSd)及柴胡皂苷c(SSc)的相對校正因子,并用相對校正因子計算柴胡皂苷d及柴胡皂苷c的含量。以統計學t-檢驗法對相對校正因子的計算值與外標法實測值進行比較,對不同品牌色譜柱、不同廠家的高效液相色譜儀及不同實驗室的實驗結果進行考察,綜合評價一測多評法在柴胡藥材中應用的準確性和科學性。1儀器、藥品和成分配測定信息Waters系列高效液相色譜儀,包括:Waters600controller,Waters600pump,Waters2487dualabsorbancedetector,WatersEmpower工作站。電子分析天平(上海天平儀器廠),KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),乙腈、甲醇為色譜純(Fisher公司)。Wahaha純凈水(市售),提取用甲醇為分析純(北京化工廠)。柴胡皂苷a(批號110777-200406)和柴胡皂苷d(批號110778-200505)均由中國藥品生物制品檢定所提供,柴胡皂苷c由本實驗室分離純化,HPLC(面積歸一化法)純度>98%。柴胡藥材收集自不同產地,經作者鑒定為北柴胡B.chinenseDC.的干燥根。對照品結構式見圖1。2方法和結果2.1測多評法確定各組分的含量在一定的線性范圍內成分的量(質量或濃度)與檢測器響應成正比,即:W=f×A。在多指標質量評價時,以藥材中某一典型組分(有對照品供應者)為內標,建立該組分與其他組分之間的相對校正因子,通過校正因子計算其他組分的含量。這種測定一個成分,實現對多個成分定量的方法命名為一測多評法。假設某樣品中含有i個組分,存在Wi/Ai=fi(i=1,2,…,k,…,m)①。式中Ai為組分i的峰面積;Wi為i組分的量。選取其中一組分k為內標,建立組分k與其他組分m之間的相對校正因子,有fkm=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)②。由此可導出定量計算公式:Wm=(Wk×Am)/(fkm×Ak)③。式中Ak為內標物峰面積,Wk為內標物量;Am為組分m的峰面積,Wm為組分m的量。2.21個研究和多評價理論的研究2.2.1柱溫度a20a色譜柱為VenusiASB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脫(0～50min,25→90%A;50～55min,90→90%A;55～60min,90→25%A;60～70min,25→25%A);流速1.0ml·min-1;柱溫30℃;檢測波長210nm。在上述色譜條件下,SSc,SSa,SSd與其它峰能達到較好的分離。對照品及樣品HPLC圖譜見圖2。2.2.2對照品溶液的制備精密稱定柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品1.02,2.05,2.39mg置于同一2ml量瓶中,用色譜甲醇定容,制得混合對照品溶液,于4℃保存備用。2.2.3超聲處理法取本品粉末(過60目篩)約0.5g,精密稱定,置50ml三角瓶中,加入5%氨水甲醇溶液25ml,密閉,于30℃水溫超聲處理30min,濾過,濾渣用甲醇潤洗兩次,每次10ml,合并濾液,回收甲醇至干。殘渣加甲醇(色譜純)溶解并轉移至5ml量瓶中,過0.45mm的微孔濾膜,即得。2.2.4色譜條件分析精密吸取上述混合對照品溶液2,5,10,15,20μl注入高效液相色譜儀,按“2.2.1”項下色譜條件進行分析。分別以對照品量C(μg)為橫坐標,峰面積Y為縱坐標,繪制標準曲線并進行回歸計算,得柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的標準曲線回歸方程及線性范圍(見表1),表明各化合物在相應范圍內線性關系良好。2.2.5采用回歸因子計算以SSa為內標,按“2.1”項下公式②,分別計算SSa對SSc和SSd的校正因子,見表2。2.2.6ssa和ssa峰面積的rsd精密吸取同一混合對照品溶液20μl,連續進樣6次,記錄SSc,SSa和SSd的峰面積,其峰面積的RSD分別為1.40%,1.30%和1.47%。表明儀器精密度良好,符合含量測定要求。2.2.7ssa和ssa峰面積比較取同一供試品溶液20μl分別于0,2,4,6,8,10h進樣測定,記錄SSc,SSa和SSd峰面積,其峰面積的RSD分別為1.70%,2.00%和2.10%。表明SSc、SSa和SSd在10h內穩定不變。2.2.8ssa和ssa含量的rsd稱取同一批柴胡藥材粉末(60目)約0.50g共6份,精密稱定,按供試品溶液處理方法制備樣品并測定,SSc,SSa和SSd含量的RSD(n=6)分別為1.20%,2.94%和2.87%。表明實驗方法重復性較好。2.2.9加樣回收率精密稱取已知含量的柴胡藥材粉末(60目)適量6份,分別加入一定量的SSa對照品,按供試品溶液處理方法制備樣品并測定,計算加樣回收率,SSa的平均回收率為101.64%,RSD(n=6)為2.33%。表明實驗方法準確度符合要求。2.2.1高效液相色譜法分別精密吸取供試品、混合標準品各20μl注入高效液相色譜儀并測定。分別采用一測多評法和外標法計算柴胡藥材中SSc、SSa和SSd含量(見表3)。2.31-測量和多評估方法的耐用性和系統適應性的評估2.3.1高效液相色譜條件的確定取“2.2.2”項下混合對照品溶液,進樣2,5,10,15,20μl,測定,按“2.2.5”項下計算SSa對SSc和SSd的校正因子。實驗考察了Waters600,Waters2690兩種高效液相色譜系統和VenusiASB-C18(4.6mm×250mm,5μm),VenusiMP-C18(4.6mm×250mm,5μm),HibarRT-C18(4.6mm×250mm,5μm)3種色譜柱。結果見表4。2.3.2實驗室研究采用建立的一測多評分析方法在兩個實驗室進行復核實驗,結果表明兩個實驗室實驗結果差異不大。見表5。2.4ssc與sd含量的比較采用統計學t檢驗,對一測多評法與常規法得到的柴胡藥材SSc和SSd含量進行比較,P>0.05,表明兩種方法測得含量沒有顯著性差異。3色譜峰的定位本實驗通過方法學驗證、方法耐用性、系統適應性考察,對一測多評法用于柴胡藥材3種皂苷含量測定的技術適用性和應用可行性進行了探討。結果表明在不同色譜柱、不同儀器及不同實驗條件下,柴胡皂苷a與柴胡皂苷c和柴胡皂苷d之間的相對校正因子(RCF)有較好的重現性(RSD分別為0.70%和0.56%)。用一測多評法計算的含量與常規的外標法測得的含量經統計學t-檢驗沒有顯著性差異,說明本研究所得的SSa對SSc與SSd的校正因子具有普適性。在本研究的色譜條件下,柴胡藥材HPLC色譜圖中色譜峰比較簡單,可以通過SSa與SSc和SSd之間的相對保留時間差進行色譜峰定位,因此在定量柴胡皂苷a、c、d含量時,只要有柴胡皂苷a一個對照品,即可通過該方法實現3種成分同步含量測定。本實驗所得的相對保留時間差RTSSa-RTSSc和RTSSa-RTSSd的平均值分別為3.7185和-5.9955min,校正因子fSSa/SSc和fSSa/SSd的平均值分別為0.742和0.945,可供參考和使用。中藥化學成分非常復雜,在不同色譜條件下有不同的色譜峰,在同一色譜條件下,其色譜峰的數量、出峰時間及峰形等也受色譜柱、儀器及溶劑系統等多種因素影響,因此如何將待測色譜峰準確定位,是“一測多評”方法能否成功應用的關健問題,需要進行深入廣泛的研究。對于在一定色譜條件下,色譜峰相對較少的中藥,可根據《中藥注射劑色譜指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》推薦使用相對色譜保留時間作為定性依據,根據內標峰的保留時間,加上相對保留時間差,再根據峰形,即能夠正確判斷出目標峰的峰位置。本實驗采用這種方法,效果良好。對于同一色譜條件下,色譜峰較復雜的中藥或復方制劑,可采用光譜相關色譜法進行色譜峰的定位,同一組分在不同色譜柱及色譜儀器中的保留時間存在差異,但他