重組DNA技術生物科學成為當今世界自然科學的熱點和重點，主要由于兩方面的原因：

（1）二十世紀后葉，分子生物學領域一系列突破性成就，使生命科學在自然科學中的地位發(fā)生了革命性的變化；

（2）建立在實驗室研究基礎上的生物技術的發(fā)展為人類帶來了巨大的利益和財富。生物技術將是未來經(jīng)濟發(fā)展的新動力

第一次技術革命 工業(yè)革命 解放人的雙手 第二次技術革命 信息技術 擴展人的大腦 第三次技術革命 生物技術 改造生命本身基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)（酶）工程

此外還有基因診斷與基因治療技術、克隆動物技術、生物芯片技術、生物材料技術、生物能源技術、利用生物降解環(huán)境中有毒有害化合物的技術直接相關聯(lián)的學科：分子生物學、微生物學、生物化學、遺傳學、細胞生物學、生物信息學、化學工程學、醫(yī)藥學等。對人類和社會生活各方面影響最大的生物技術領域：

農(nóng)業(yè)生物技術、醫(yī)藥生物技術、環(huán)境生物技術、海洋生物技術生物技術的主要內(nèi)容

基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術的方法，把DNA作為組件，在細胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細胞，使外源基因DNA在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表達，最終獲得基因表達產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。基因重組技術作為分子生物學最重要、最基本的技術之一，是許多分子生物,生物化學和細胞生物學實驗實施的基礎。

現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·伯格（美國,1926－）在1960年以敏銳的科學預見力提出一個大膽的設想：是否可以創(chuàng)造出一種人工方法，把外界的遺傳基因引入動物體內(nèi)，以達到改變遺傳性狀和治療某些疾病的需要呢？1972年，伯格把兩種病毒的DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，首次實現(xiàn)兩種不同生物的DNA體外連接，獲得了第一批重組DNA分子，這標志著基因工程技術的誕生。伯格因此獲得了1980年諾貝爾化學獎。

1973年，美國斯坦福大學教授S·科恩和加州大學舊金山分校教授H·W·博耶將兩個不同的質(zhì)粒（一個是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導入大腸桿菌，當該重組質(zhì)粒進入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。這表明“雜合質(zhì)粒”在大腸桿菌的細胞分裂時也能自我復制。

科恩隨后以DNA重組技術發(fā)明人的身份向美國專利局申報了世界上第一個基因工程的技術專利。這標志著自然界不同物種間在億萬年中形成的天然屏障被打破了，人類可以根據(jù)自己的意愿定向地改造生物的遺傳特性，甚至創(chuàng)造新的生命類型。

1977年，吉爾伯特（W·Gilbert）分別將編碼胰島素和干擾素的DNA經(jīng)過體外重新拼接后，導入大腸桿菌中，分別使大腸桿菌合成了胰島素和干擾素。

基因工程的應用重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）克隆:目的基因與載體連接，形成重組的DNA分子；（3）轉(zhuǎn)化：用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細胞，并能在受體細胞中復制和遺傳；（4）篩選：對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）大量培養(yǎng)：對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產(chǎn)物。DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克隆）表（達目的基因）“縱向”體系

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術路線(分)------目的基因及載體的分離獲得需要的目的基因常用的方法：（1）化學合成（2）基因組文庫(genomicDNAlibrary)（3）cDNA文庫（4）聚合酶鏈式反應（PCR）化學合成根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應于編碼小分子多肽的基因。較短的核酸片段（60-80bp）

多肽鏈的氨基酸順序mRNA的堿基排列順序相應的基因結構化學合成目的基因化學合成的不足之處在于：（１）要已知基因的核苷酸順序；（２）基因不能太大，這一方面是測定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因為每次僅能合成幾百ｂｐ的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低；（３）價格昂貴。化學合成的最大優(yōu)點是可以合成一些分離較困難的基因。用途：PCR引物,測序引物,定點突變,核酸雜交探針基因組文庫細胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因組文庫的構建基因組DNA：在真核生物體，基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）和線粒體DNA的全部序列。基因組文庫基因組文庫是含有某種生物全部基因片斷的DNA克隆群體。直接從生物體中提取總DNA，用超聲或酶處理，將染色體DNA切割成片斷，插入載體，轉(zhuǎn)入受體菌擴增，得到基因組DNA文庫，從中調(diào)用目的基因；缺點:結構基因只含基因組很小一部分，有重復序列，假基因。真核生物基因組有內(nèi)含子。這些給從基因組克隆目的基因帶來困難。細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序苯酚沉淀蛋白質(zhì)乙醇濃縮DNA組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌將總DNA經(jīng)過酶解，經(jīng)蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳分離不同長短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上，轉(zhuǎn)染細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構成了該生物的基因組文庫。基因組DNA文庫cDNA文庫cDNA文庫的構建mRNA

反轉(zhuǎn)錄酶cDNA(互補DNA）

DNA聚合酶第二條DNA鏈用細胞總mRNA，制備全套雙鏈cDNA后，建立的基因文庫。簡稱c－DNA文庫。以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶，合成與mRNA互補的cDNA(complementaryDNA,cDNA)片段，插入載體，轉(zhuǎn)入受體菌擴增，得到cDNA文庫；比較基因組文庫與cDNA文庫構建基因組文庫獲取目的基因存在的問題——

費時費事 內(nèi)含子序列反轉(zhuǎn)錄人工合成互補DNA方法的優(yōu)勢——

不含內(nèi)含子序列獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因?qū)O微量的生物標本化為可供鑒定的現(xiàn)代技術PCR(Polymerase

chain

reaction)--聚合酶鏈式反應分子生物學，醫(yī)學，考古，法醫(yī)美國Mullis教授1988年發(fā)明了PCR技術1993年獲得諾貝爾獎聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）PolymeraseChainReaction載體DNA的選擇可轉(zhuǎn)移性,為目的基因提供進入受體細胞的轉(zhuǎn)移能力。合適的復制位點,為目的基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力。多克隆位點：廣泛、特異選擇標志，便于篩選和鑒定分子較小，可容納較大的外源DNA理想載體的基本條件：質(zhì)粒噬菌體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體……種類：質(zhì)粒載體的一般結構存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。具有自我復制功能。帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標記物。經(jīng)改造后具有多克隆位點。DNA重組的基本模式

分（離目的基因）

切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克隆）表（達目的基因）“縱向”體系切------限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切酶切載體和目的基因的切斷通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)，簡稱限制酶，分別對載體DNA和目的基因進行切斷，以便于重組。限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400多種，所識別的順序往往為4-8個堿基對，且有回文結構。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesiveend)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。

DNA重組的基本模式

分（離目的基因）

切（割目的基因和載體）

接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克隆）表（達目的基因）“縱向”體系接------載體和目的基因的連接即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。（一）粘性末端連接法：當載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進行切斷時，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進行互補粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。較少的情況下，對產(chǎn)生的平端也可直接進行連接。

載體DNA與目的基因的連接（二）人工接尾法：即同聚物加尾連接法。當載體和目的基因無法采用同一種限制酶進行切斷，無法得到相同得粘性末端時，可采用此方法。此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3'-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補進行粘合，再由DNA連接酶連接。（三）人工接頭連接法：將人工連接器（linker,即一段人工合成的含有多種限制酶切點的小分子DNA片段,約10~20個核苷酸，）連接到平末端DNA分子(載體和目的基因)上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進行切斷，得到可以互補的粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。DNA重組的基本模式

分（離目的基因）

切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克隆）表（達目的基因）“縱向”體系轉(zhuǎn)------重組體的轉(zhuǎn)化受體細胞重組體的轉(zhuǎn)化宿主菌或受體細胞②真核系統(tǒng)酵母菌酵母昆蟲細胞哺乳動物細胞①原核系統(tǒng)大腸桿菌枯草桿菌原核細胞的轉(zhuǎn)化（細菌轉(zhuǎn)化）受體細胞的選擇限制缺陷型:避免修飾和降解重組缺陷型：避免重組整合轉(zhuǎn)化親和型：較高的可轉(zhuǎn)化性遺傳互補型：利于篩選感染缺陷型：防止感染感受態(tài)細胞（competentcell）所謂感受態(tài)，就是細菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2等化學試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Competentcells)。大腸桿菌細胞大腸桿菌感受態(tài)細胞得到噬菌斑或單菌落與重組DNA共同冰浴而后42℃短暫熱刺激CaCl2處理受體細菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細菌重組體轉(zhuǎn)入細菌轉(zhuǎn)化E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化：在高壓電場下使細胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個穿孔足夠大并可維持足夠的時間，使外源DNA進入受體細胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高2~3個數(shù)量級。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化方法真核細胞的轉(zhuǎn)染

受體細胞系統(tǒng)

永生細胞系細胞特異性的選擇標記對抗某種藥物電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術：主要用于動物細胞的轉(zhuǎn)染。將DNA溶液加入到CaCl2中，然后在強烈震蕩下加入由Na2HPO4和NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細胞中，利用細胞的胞飲作用將DNA導入到細胞中。磷酸鈣一方面可以增加細胞的通透性，一方面可以避免DNA被細胞內(nèi)的核酸酶水解。磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染重組體

+

磷酸鈣微粒內(nèi)吞作用重組體進入細胞大顆粒基因槍轉(zhuǎn)染法：利用被電場或機械加速的金屬微粒能夠進入細胞內(nèi)的基本原理，先將DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進入細胞內(nèi)。激光微束穿孔法：利用直徑很小、能量很高的激光束在細胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA進入細胞。顯微注射法：利用毛細管直接將DNA注入細胞內(nèi)。脂質(zhì)體（liposome）介導法：將DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結構內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細胞膜的融合而將DNA導入細胞內(nèi)。多聚物介導法：利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價陽離子、DNA混合形成沉淀顆粒，通過細胞的胞飲作用而進入細胞內(nèi)。DNA重組的基本模式

分（離目的基因）

切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）

篩（選陽性克隆）表（達目的基因）“縱向”體系重組體克隆的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的克隆群體：陽性重組子的篩選與鑒定1、遺傳檢測法(根據(jù)重組載體的標志作篩選)------插入失活法

------α-互補法2.限制性酶切法3.PCR法4.雜交篩選法5.免疫學方法6.核苷酸序列測定法遺傳檢測法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。

對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進行篩選。如pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細菌對氨芐青霉素耐藥，而對四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長的細菌即為帶重組體的細菌。

如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活pBR322質(zhì)粒結構pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板α-互補法——藍白篩選現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和N端１４６個氨基酸偏碼區(qū)（全長1201氨基酸）。這個編碼區(qū)中插入一個多克隆位點。受體菌是Z基因突變型，只含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。當外源基因插入時，在IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）誘導下合成β－半乳糖苷酶N端片斷,和受體菌的C端片斷溶為一體后，可產(chǎn)生蛋白質(zhì)間的互補，形成有活性的β－半乳糖苷酶,稱α互補。具有α互補的細菌培養(yǎng)在含IPTG及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培養(yǎng)基上.X-gal本身是無色的，在半乳糖苷酶的水解下產(chǎn)生蘭色的物質(zhì)（被水解為無色的半乳糖及深蘭色的5-溴-4-氯靛蘭），因此會形成藍色菌落。而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入突變失活，則不能產(chǎn)生α互補，因此菌落是白色的。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。IPTG起誘導表達的作用，相當于乳糖，但它的誘導效率遠高于乳糖。α-互補法限制性酶切法經(jīng)過粗篩后的含重組體的細菌，還需進行限制酶譜分析進一步鑒定。將單一細菌進行擴增后分別提取其DNA，用重組時所用的同一限制酶進行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。

凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒的PCR擴增片段PCR法利用的目標引物(例如分離目的基因所使用的引物),抽提需要篩選的克隆的重組DNA作為模板,進行PCR擴增,根據(jù)是否擴增出目的片段來確定陽性克隆.雜交篩選法為了進一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因部分互補的DNA片段作為探針，與含有重組體的細菌菌落進行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結果為陽性，即可確定重組體中帶目的基因。

32P標記的DNA分子探針雜交放射自顯影法分子雜交依據(jù)：堿基互補配對原則①合成核酸探針（與所需基因互補的核苷酸短鏈，并用同位素標記）②升高溫度或改變pH使DNA變性③分子雜交（常用原位分子雜交）如果基因文庫中的一個DNA片段能和探針結合形成雙鏈，這一片段即含有所需基因。步驟：免疫化學檢測法

濾膜（固定抗體）+DNA序列分析法該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。ACTGAAGGCTDNA重組的基本模式

分（離目的基因）

切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克隆）

表（達目的基因）“縱向”體系外源基因在宿主細胞中的表達重組子目的基因的mRNA表達蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）受體細胞外源基因在宿主細胞中的表達原核生物基因結構和表達特點原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進行。原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體結合，翻譯形成多條肽鏈。

3、一般不含內(nèi)含子（intron），沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)。

4、原核生物中功能相關的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。操縱子是一組功能上相關，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個遺傳單位。啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

一般長40-60bp，富含A-T堿基對具有保守序列：

-10區(qū)（pribnowbox）：TATAAT

-35區(qū)：

終止子（terminator，T）:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列5、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結構：翻譯起始密碼子AUG或GUGSD順序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp長約3-9bpmRNA與16s核糖體亞基間的識別與結合序列

6、與翻譯有關的原核細胞結構：——核糖體結合位點人類對大腸桿菌經(jīng)過長期的研究，對其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達工具已有幾十年的經(jīng)驗積累，大腸桿菌表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。因此大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。設計外源基因在大腸桿菌表達就需要外源基因在大腸桿菌中表達所需要的元件，包括轉(zhuǎn)錄起始必需的啟動子、翻譯起始所必需的核糖體識別序列等；外源基因表達的產(chǎn)物可能會對大腸桿菌有毒害作用，會影響細菌的生存繁殖，所以大多數(shù)表達載體都帶有誘導性表達所需要的元件，即有操縱子序列以及與之配套的調(diào)控基因等；外源基因還應當插入到適合于表達的位置，所以表達載體中要設有適合的多克隆位點；此外還應具備基因克隆篩選的條件，包括在細胞中復制必需的復制起始序列、篩選標志如抗藥性基因等。原核表達載體(expressingvector)特點：帶表達構件—轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列大腸桿菌表達載體：含啟動子—核糖體結合位點—克隆位點—轉(zhuǎn)錄終止信號啟動子：trp-lac(tac)啟動子、λ噬菌體PL啟動子、T7噬菌體啟動子核糖體結