RegulationofGeneExpression第六章基因表達的調控Chapter6Theone-dimensionalgeneticinformationDNAmRNAAUGpolypeptideProtein

Thethree-dimensionalinformationButnotallgenesareexpressedinallcellsallthetimeOneofthebeststrategiesforanorganism’ssurvivalistobeabletoadaptquicklytochangesinitsenvironment.Infact,afundamentalpropertyoflivingcellsistheirabilitytoturntheirgenesonandoffinresponsetoextracellularsignals.生物生存的最好策略之一就是能夠盡快適應變化了的環境。事實上，依據胞外信號打開或關閉基因表達，是活細胞具有的基本特性。Thiscontrolofgeneexpressionmakesitpossibleforcellstoproducespecifickindsofproteinswhenandwheretheyareneeded.控制基因的表達，可以使細胞在一定的時空條件下，產生其所需的一組特定蛋白質。DifferentialGeneExpression基因的差異表達E.coligenome4.6106bp,4288ORF.DetailanalysisofproteininE.colihasshownthatformorethan107polypeptidechainspercell,theneachpolypeptidechainshouldhad2300copiespercell.Someproteinsmaybepresentinasfewas5-10moleculespercell,whereasothers,suchasribosomalproteinsandthemanyproteinsinvolvedintheglycolyticpathway,are

presentinasmanyas100,000copiespercell.在每個細胞中，有些蛋白質僅有5-10個分子拷貝，而另一些蛋白質如核糖體蛋白以及許多參與糖代謝的蛋白質卻高達10萬個分子拷貝。Ineukaryotes,essentiallyallthecellscontainthesamegenes,butthesetofgenesexpressedinformingonecelltypeisdifferentfromthatexpressedinforminganother.真核生物的所有細胞都含有相同的基因，但在一種類型細胞中表達的一套基因與另一種類型細胞中表達的基因是不同。Obviously,geneexpressioncanberegulatedbycontrollingthesynthesisofmRNAorprotein.Regulationofgeneexpressionmakescellularadaptation,variation,differentiation,anddevelopmentpossible.闡明的科學問題真核與原核生物如何調控數以千、萬計的基因以最為經濟、有效的時空模式進行轉錄，從而實現對環境的適應、細胞的分化,組織的特化，形態的發生和個體的發育。Howisgeneticexpressionregulated?基因表達的時間特異性（temporalspecificity）:是指特定基因的表達嚴格按照特定的時間順序發生，以適應細胞或個體特定分化、發育階段的需要。又稱為階段特異性。基因表達的空間特異性（spatialspecificity）:是指多細胞生物個體在某一特定生長發育階段，同一基因的表達的細胞或組織器官不同，從而導致特異性的蛋白質分布于不同的細胞或組織器官。故又稱為細胞特異性或組織特異性。6.1原核生物與真核生物基因在表達調控機制

具有驚人的相似性共同的起源與共同的分子基礎調控機理上調控層次上InteractionbetweennucleicacidsInteractionbetweennucleicacidsandprotein.Interactionbetweenproteins.transcriptionallevelPost-transcriptionalleveltranslationallevelPost-translationallevel結構改變緊密的DNA松弛的DNAAAAn轉錄mRNA加工RNA穩定翻譯翻譯基礎上進行修飾修飾的蛋白質（有活性）加工后的mRNA蛋白質（無活性）前體mRNAGeneExpressionisregulationatanumberofdistinctlevelsRNAtranscription:on/off、amount、processing（加工）.ProteinTranslation:rate、amount、processing、degradation.MannerofGeneticexpression

Transcripome

isthecompletesetofgenesexpressedunderparticularconditionsinacell,tissue,ororganism.轉錄組：是一個細胞、組織或有機體在特定條件下表達的一組完整的基因。constitutiveexpressionLuxurygenes奢侈基因是在特定細胞中大量合成有特殊功能的蛋白質.Housekeepinggenes

（Constitutivegenes)持家基因（組成型基因）：在所有細胞中都表達，它們提供所有的細胞生長所需的基本物質.inducibleexpression6.2轉錄水平上的調控是最為經濟、靈活，

又是最為重要、復雜的調控

在復雜的基因組內，確定需要基因轉錄的起始位點；

精細調節基因表達的水平,以保證生物體對環境的適應；cis-element&trans-factor間嚴格而靈活的互作；

保證RNApol的進行性轉錄（不中斷，準確終止）；6.3原核生物基因表達調控的理論與模式LacoperonrepressorproteinbindingtoDNA6.3.1transcriptionallevelcontrolOperon（操縱子）

stringentresponse（應急反應）

Attenuator（弱化子）

Transposon（轉座子）原核生物的基因表達調控經常發生在轉錄水平，尤其表現在轉錄的起始上。Inbacterialsystem,whenseveralenzymesactinsequenceinasinglemetabolicpathway,usuallyeitherallornoneoftheseenzymesareproduced.在細菌系統中，順次參與同一代謝途徑的酶通常會同時在細胞中合成。Thephenomenon,coordinateregulation,resultsfromcontrolofthesynthesisofasinglepolycistronicmRNAmoleculethatencodesallofthegeneproducts.

這種現象稱為協同調節。是通過控制能夠編碼所有基因產物的多順反子mRNA的分子合成的結果。大腸桿菌乳糖操縱子

IPOZYA調控基因啟動子操縱基因半乳糖苷酶半乳糖通透酶轉乙酰基酶

Operonisaunitofbacterialgeneexpressionandregulation,includingstructuralgenesand

cis-actingcontrolelementsinDNArecognizedbyregulatorgeneproduct(s).操縱子是細菌基因表達調控的單元，包括結構基因以及能夠被調節基因產物所識別的存在于DNA分子上的順式作用元件。FrancoisJacobJacquesMonodOperoncontrol

(1961Jacob&Monod，PhysiologyorMedicine1965)

操縱子調控模型：控制某一代謝途徑的相關基因,緊密連鎖地排列在一起,受同一操縱子控制。PromoterOperator

cis-actingregulatoryelements反式作用調節因子的基因有自己的啟動子和終止子

各結構基因按一定比例協調翻譯(Z:Y:A=5:2:1);

具有極性突變效應(polarity)：位于前面的結構基因發生突變，導致翻譯終止，使多順反子中突變位點下游的基因不表達。

P&O基因（cis）緊密連鎖或彼此重疊，I基因（trans）位點不固定。PlacI+lacI+lacZ+lacY+lacA+terminatorPlac+lacO+

結構基因簇被協同調控;operoncontroltype：Negative&PositiveNeg.Pos.

I-

or不加入I基因產物

operonon

I+

or加入I基因產物

operonoffI-or不加入I基因產物

operonoffI+

or加入I基因產物

operonon抑制蛋白NegativePositive誘導蛋白I

gene●RepressorbindingonOsite●Operonoff●Negativecontrol是廣泛保險的機制（自然選擇使Prok.獲得選擇優勢）Positivecontrol是靈活、嚴格、經濟的調控機制ApoinducerbindingfrontPsite

意味轉錄效率極低阻止轉錄啟動激活轉錄啟動Model：模型●

兩種模型都需要信號分子的參與：Addsignalmol.

OperononAddsignalmol.

OperonoffCo-repressor（輔阻遏物）Inducer（誘導物）(inducibleoperon)(repressibleoperon)原核基因調控機制的類型和特點基因表達的調控主要發生在轉錄水平上，根據調控機制不同，可以分為負調控和正調控。在負調控中，調節基因產物是阻遏蛋白，起阻止結構基因轉錄的作用。根據其作用特征又可以分為負控誘導和負控阻遏兩大類。在負控誘導系統中，阻遏蛋白不與效應物結合時，結構基因不轉錄；在負控阻遏系統中，阻遏蛋白與效應物結合時結構基因不轉錄。阻遏蛋白作用的部位是操縱區。在正調控系統中，調節基因的產物是激活蛋白。可以根據激活蛋白的性質分為正控誘導系統和正控阻遏系統。正控誘導系統中，效應物分子的存在使激活蛋白處于活性狀態；正控阻遏系統中，效應物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態。NegativecontrolInactiverepressor

InductionandrepressioncanbeunderpositiveornegativecontrolRepressorInducerInductionCorepressorActiverepressor

Inactiverepressor

RepressionPositivecontrolInactiveactivator

InducerActiveactivator

Activeactivator

Inactiveactivator

Corepressor沒有調節蛋白時操縱元內結構基因是表達的，而加入調節蛋白后結構基因的表達活性被關閉，這種調節稱為負調節。Negativeregulation：arepressorproteinbindstoanoperatortopreventagenefrombeingexpressed.負調控：阻遏蛋白結合在操作子位點，阻止基因的表達。3’5’阻遏物阻止RNA聚合酶起始轉錄GeneturnedonbecauseRNApolymeraseinitiatestranscriptionatpromoter當阻遏物結合到操縱子處，基因的表達關閉3’5’StructuralgenePromoterPositiveregulation：atranscriptionfactorisrequiredtobindatthepromoterinordertoenableRNApolymerasetoinitiatetranscription.正調控：轉錄因子結合在啟動子位點，是RNA聚合酶能夠起始轉錄所需要的。沒有調節蛋白時操縱元內結構基因的轉錄活性是關閉的，而加入調節蛋白后結構基因轉錄活性被開啟，這種調節方式稱為正調節。3’5’TranscriptionfactorsassistRNApolymeraseGeneturnedonbyactivatorsStructuralgeneGeneturnedoffbydefaultStartpointStructuralgenePromoter3’5’Repressor:isaproteinthatinhibitsexpressionofagene.ItmayacttopreventtranscriptionbybindingtoanoperatorsiteinDNA,ortopreventtranslationbybindingtoRNA.阻遏蛋白：抑制基因表達的蛋白質，通過結合在DNA的操縱子位點上而阻止轉錄；或結合在RNA分子上而阻止翻譯。Apoinducer:

isrequiredforRNApolymerasetoinitiatetranscriptionatspecific

promoter,butisnotitselfpartoftheenzyme.誘導物：是RNA聚合酶在特定起始子位點起始轉錄所必需的，但無輔基誘導蛋白本身并不是聚合酶的組成組分。Induction

referstoswitchingontranscriptionasaresultofinteractionoftheinducerwiththeregulatorprotein.誘導：通過誘導分子與調節蛋白的相互作用而起始轉錄的過程。Repression

referstoinhibitionoftranscription(ortranslation)bybindingofrepressorproteintoaspecificsiteonDNA(ormRNA)byinteractionofthe

corepressor.阻遏：通過與輔阻遏分子的相互作用，而使阻遏蛋白結合在DNA（或RNA）特定位點上的從而阻止轉錄（或翻譯）的起始。Inducerisasmallsignalmoleculethattriggersgenetranscriptionbybindingtoaregulatorprotein.誘導物是通過與調節蛋白結合而觸發基因轉錄的小分子。Corepressorisasmallmoleculethattriggersrepressionoftranscriptionbybindingtoaregulatorprotein.

輔阻遏物是通過與調節蛋白結合而抑制基因轉錄的小分子。P218降解物對基因活性的影響在有葡萄糖的時候，即使細菌的培養基中有乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等誘導物，相對應的操縱子也不會開啟，不會產生出相對應的酶類，這叫葡萄糖效應或降解物抑制作用。因為有葡萄糖的存在，細菌所需要的能量能夠從葡萄糖得到滿足，它是最方便的能源，無需開動一些不常用的基因去利用這些稀有的糖類。

6.3.1.1乳糖操縱子和負控誘導系統大腸桿菌的乳糖操縱子（lactoseoperon）包括三個結構基因Z、Y和A，以及啟動子、控制子和阻遏子等。轉錄時，RNA聚合酶首先與啟動區P結合，通過操縱區O向右轉錄。轉錄產物的每一條mRNA上都有這三個基因。轉錄的調控是在啟動區和操縱區進行的。0246810Bacterialdensity(cells/mL)Time(h)LactoseE.coliE.coliGlucoseNegative—inducibleoperon

（lactoseoperon）GlucoseusedLactoseused酶可以形成的原因是編碼它們的基因在有相應糖類物質存在時可以被活躍轉錄。如果沒有糖類的出現這些基因是不轉錄的。換句話說，這些基因是被調節的基因，只在特定的階段產生它們的產物。β-Galactosidase

β－半乳糖苷酶β-Galactosidepermease

β－半乳糖苷透性酶β-Galactosidetransacetylase

β

－半乳糖苷乙酰基轉移酶lacIPromoterOperatorlacZlacYlacA

Repressor38kd/monomer如果乳糖操縱子是被抑制的，沒有透性酶將乳糖帶到細胞中，沒有β－半乳糖苷酶催化反應的發生，乳糖是如何代謝生成異乳糖的？異乳糖OOHOHOHCH2OHOOHOCH2OHOHOHOOHOHOHCH2OHOOCH2OHOHOHOHOHlactose

β-galactosidase

Whatisthenatureofthisinducer?

Whentranscriptionisinthe“off”state,abasallevelofgeneexpressionnearlyalwaysremains,oftenaveragingonetranscriptionaleventorfewerpercellgeneration;hence“off”reallymeansthatthereisverylittlesynthesisofthegeneproduct.當轉錄處于關閉狀態時，幾乎總是保持一個本底水平的基因表達，在每個細胞世代中，通常只有一個或少數幾個轉錄事件的發生；因此，關閉的真正含義是指有較少基因產物的合成。換句話說，如果操縱子處于被抑制狀態，誘導物是如何進入到細胞中去起始誘導過程的？?Thebasalleveloftranscriptionofageneisthelevelthatoccursintheabsenceofanyspecificactivation.一個基因的本底水平的表達是指在沒有任何特殊激活物存在時的表達水平someinducerentersanywayviaanotheruptakesystem.總會有一些誘導物可通過其他途徑被攝入到細胞內SnowballrollingOnlyabout10tetramersofrepressorarepresentpercell.由于每個細胞中大概有10個四聚體抑制物的存在，因此不需要太多的誘導物就可以啟動乳糖操縱元的表達。Moreandmoreoperonproductsareavailabletoproducemoreandmoreinducer.隨著乳糖操縱元產物的增多，會引起更多誘導物的形成，就像滾雪球一樣。

024681012minInducedlevelBasallevelBasallevelAddinducerRemoveinducerLeveloflacmRNALevelofβ-galactosidaseBasallevelInducedlevelLagLac基因的轉錄調控對于誘導物的應答非常迅速，當誘導物不存在時，操縱元以極低的本地水平表達。誘導物的加入會立即激活轉錄，此時lacmRNA的數量迅速增加至誘導水平，從而達到mRNA合成與降解的平衡。lacmRNA翻譯產生β-半乳糖苷酶。第一個酶分子的出現稍微落后于lacmRNA的出現。在mRNA和蛋白質達到最高水平之間也存在同樣的延遲。當誘導物一旦除去，酶的合成立即停止，但β-半乳糖苷酶在細胞中比mRNA更為穩定，所以酶活性可保持在誘導水平時間較長.

IPTG

（異丙基硫代半乳糖苷）極強的誘導劑%InputDNA-boundCohn.JournalofMolecularBiology,Vol.34:366.1968Repressor(μg/ml)102030400.10.20.30.4-IPTG+IPTGbindingbetweenlabeledlacO-DNAwith32pandaddedincreasingamountsoflacrepressor.IPTG;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，自己不被分解的強誘導物LacorIPTG

lactoseanalog

isinducerofLacoperonmRNAstartpointRNApolymerasebindingRepressorbinding-50-40-30-20-101102030Olac(operator)cis-actionelementunwinding阻遏?競爭?雙鏈DNA具有回文對稱性，能形成十字型的莖環結構Olac(操作子)乳糖操縱元的順式作用元件研究發現，乳糖操縱元的操作子與啟動子具有一定的重疊，那么阻遏蛋白的阻遏作用是通過與RNA聚合酶發生競爭性結合還是通過空間位阻來實現的？Olac(operator)cis-actionelementATGTTACTTACAATGA+578910111417這8個堿基每一個堿基的替換都會引起結構基因的組成型表達。TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT+10+5+1-5-10+15+20+25-7+28Protectedbyboundrepressor

嘌呤被抑制物保護以防甲基化

嘌呤的甲基化由于抑制物的結合而增強T能夠與抑制物交叉結合

O+—mut.

OCoccurfrequentlyatleftsiteofaxisO+突變成OC

（操縱子組成型突變）經常發生在軸的左側TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT+10+5+1-5-10+15+20+25-7+28ATGTTACTTACAATGA+578910111417ConstitutivemutationsOclac操縱子與抑制物的結合能力要低于野生型的操縱子與抑制物的結合力。Oc需要高濃度的抑制物存在才能夠實現與操縱子的充分結合。wild-typeoperator(O+)operator-constitutivemutation(Oc)controlλФ80DNA

TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT+10+5+1-5-10+15+20+25-7+28

阻遏Olac(operator)cis-actionelementExperiment：聚合酶＋含有操縱子的DNA＋阻遏物共同培養，

＋誘導物IPTG和利福平，Result：可以發生轉錄Conclusion：RNA聚合酶與啟動子的結合，開放的啟動子復合物的形成但是由于抑制物的阻擋，不能時開放的轉錄起始復合物轉換為延伸狀態。假如阻遏物能阻止開放的啟動子復合物形成，如果加入利福平會與RNA聚合酶結合，使之失去與啟動子結合的能力，就不能起始轉錄。試驗結果說明加入利福平前開放的啟動子復合物已經形成，加入誘導物后解除了阻遏物的抑制作用。?TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT+10+5+1-5-10+15+20+25-7+28CompetitionOlac(operator)cis-actionelement2.302.342.382.4220004000600002.26熒光強度Time(sec)Noaddition+Heparin+RepressorNoDNARNA聚合酶，啟動子和操縱子的DNA，然后研究由此復合物、加入了抑制物或加入了肝素之后引導的流產式的轉錄合成。通過UTP類似物（熒光標簽在γ磷酸上，*pppU）檢測了轉錄產物。如果*pppU加入到了正在合成的RNA中，標記的磷酸會脫離掉，熒光的強度會降低。聚合酶和抑制物競爭結合操縱子如果有肝素和抑制物，轉錄的水平會大大下降。加入肝素，它與聚合酶結合，阻止了聚合酶與DNA的結合，可以使轉錄產物減少。加入了低濃度的抑制物，與聚合酶競爭作用位點，在一定程度上阻止了聚合酶的移動。對照是沒有DNA的試驗。O和P是重疊的，抑制物和RNA聚合酶的結合位點在操縱子的起始位點附近重疊。repressor&RNApolymerase對重疊位點競爭以上試驗證明競爭的假設是正確的O+—mut.

OCoccurfrequentlyatleftsiteofaxisRepressor對重疊位點的競爭力下降有利于RNApolymerase的結合---調控機理Inducer(Alloactose)

與repressor

特異結合tetramer變構

特異結合力下降1000X作用于O

位點上的repressor

變構

脫離O位作用于游離的repressoroperononrepessortetramer與operator發生特異結合

operonoff

變構

失去結合于O位的能力操縱子上的基因在翻譯的時候，核糖體沿著多順反子移動，在翻譯完上一個基因編碼的蛋白質后，核糖體解離，小亞基不立即從mRNA上解離而是繼續沿著mRNA移動，直到遇到下一個基因的起始密碼，核糖體重新聚合，翻譯下一個蛋白質。lac操縱子的本底水平表達在沒有誘導物存在時，也能夠合成透過酶，才能夠把第一個誘導物從細胞膜外運送到細胞膜內發揮其功能。乳糖不與阻遏物結合，真正的與之結合的是乳糖的異構體——異構乳糖，是在β-半乳糖苷酶的催化下形成的。所以這同樣需要在非誘導狀態下有少量的lacmRNA的合成，這種合成稱為本底水平的組成型合成。由于阻遏物與操縱區的結合不是非常緊密的，偶爾也會從操縱區上掉下來，這樣就可以開始mRNA的合成。lacI基因產物及功能阻遏物lacI基因的產物是由弱啟動子誘導的組成型表達的。阻遏蛋白由四個相同的亞基組成。能夠與IPTG結合。當I基因的弱啟動子變為強啟動子時，細胞內不能產生足夠的誘導物來克服阻遏狀態，整個操縱子在突變體中不可誘導。大腸桿菌對乳糖的反應在以甘油為碳源的培養基中，lac操縱子的本底表達使每個細胞中有1-2個兩類的酶分子存在。加入乳糖，乳糖分子可以進入細胞內變構形成異構乳糖，與阻遏物結合導致lacmRNA的表達，產生出大量的酶分子，酶分子繼續作用于培養基中的乳糖，促進了此類循環。當培養基中的乳糖消耗完后，阻遏物的合成繼續進行，導致操縱子的mRNA的合成被阻止。葡萄糖對lac操縱子的影響如果將葡萄糖和乳糖同時加入到培養基中，大腸桿菌在消耗完葡萄糖之前是不會利用乳糖的。葡萄糖對lac操縱子的抑制是間接的。例如一個大腸桿菌突變體，它在糖酵解途徑中不能將葡萄糖-6-磷酸轉化為下一個代謝中間產物，這個細菌中在有葡萄糖存在時也可以誘導lacmRNA的表達。說明不是葡萄糖而是它的某些代謝產物抑制了lacmRNA的合成。將葡萄糖的這種效應稱為分解代謝物阻遏效應。lac操縱子中的其他問題A基因的生理功能：抑制β-半乳糖苷酶產物的有害性衍生物在細胞內的積累，對生物的進化有積極作用。Lac基因產物數量上的比較：三個基因的酶分子的拷貝數比例是1：0.5：0.2。不同的酶在數量上的差異是由于在翻譯水平上受到調節的結果。操縱子的融合與基因工程：lac啟動子是一個很強的啟動子，通過它可以使弱啟動子的轉錄增強。從而增加蛋白質的合成量。此技術經常應用于基因工程中。操縱子突變P221操縱基因突變和順式顯性最早通過組成型突變鑒定了操縱基因，這種突變被稱為Oc，是一種組成型突變。與發生Oc突變相鄰的結構基因呈組成型表達，其機制是突變使操縱基因改變，不再與阻抑蛋白結合，因此阻抑蛋白不能阻止RNA聚合酶起始轉錄，于是操縱子持續不斷地表達。操縱基因控制著鄰近的基因，而對細胞內存在的其他等位基因無作用。此位點的突變，如Oc突變稱為順式顯性(cis-dominance)突變。順式顯性突變的概念適用于其功能是被識別而不是轉換成可擴散性產物的任何DNA序列的突變。因此，順式顯性突變屬于順式作用位點突變。乳糖操縱子突變類型調控基因（I）mutant突變發生在阻遏蛋白的DNA結合位點

表達產物失去與O的結合能力突變發生在阻遏蛋白與效應物結合位點

表達產物失去與效應物的結合能力operonon

Icoperonoff

Is操縱基因（O）mutantOc

操縱基因突變使起不再與阻遏蛋白結合operonon

Oc乳糖操縱子突變類型調控基因（I）mutant突變發生在阻遏蛋白的DNA結合位點

表達產物失去與O的結合能力operonon

Ic操縱基因（O）mutantOc

操縱基因突變使起不再與阻遏蛋白結合operonon

OcIcZ+/I+Z+OcZ+/O+Z+operonoffIc對I+表現為隱性operononOc對O+表現為顯性操縱子不可誘導型突變操縱子不可誘導型突變在遺傳學上可分成兩類。每一類的顯性關系都能用于確定基因座的性質。啟動子突變是順式作用。如果突變使得RNA聚合酶不能與Plac結合，就會使操縱子不能轉錄而喪失功能。阻抑蛋白失去結合誘導物能力的突變被稱為lacIs（超阻型突變）。在這種突變中，由于阻抑蛋白上誘導物的結合位點缺失，加入誘導物也不起作用，所以不可能將阻抑蛋白轉變成非活性形式。Positive—inducibleoperon(多為分解酶類)PositivecontrolInactiveactivator

InducerActiveactivator

cAMPcontrol(普遍調控系統

)p224LacoperonopenbutnotranscriptsGlucoseLactoseE.coliWhy?葡萄糖缺乏時葡萄糖充足時葡萄糖充足時cAMP水平很低，且cAMP很少與CAP結合1葡萄糖含量低時cAMP水平很高1CAP很容易結合cAMP，形成復合物結合DNA2增加聚合酶結合的效率3RNA聚合酶無法高效地結合到DNA上2cAMPcAMPcAMPcAMPplacICAPcAMPCAPCAPcAMP轉錄并翻譯透性酶β半乳糖苷酶轉乙酰酶乳糖葡萄糖半乳糖cAMPcAMPplacICAPCAP低水平轉錄結構基因高效率的轉錄和翻譯4××ATPpppcAcAMPpcA5’-AMPpcAI(capgene)(cAMP受體蛋白或代謝物基因激活蛋白)p224cAMPase(-)磷酸二酯酶(+)+GlucoseLacOperonIPO

在轉錄一章我們了解到，RNA聚合酶起始轉錄需要CAP-cAMP與RNA聚合酶的CTP相互作用才能有效起始轉錄。而細胞內cAMP的濃度恰好受到葡萄糖代謝產物的影響。其具體機制如下：葡萄糖的代謝產物會抑制細胞內腺苷酸環化酶活性，同時激活磷酸二酯酶的活性，而者共同作用的結果是導致細胞內cAMP的濃度很低，不足以活化CAP。這樣即使異乳糖使阻遏蛋白失活，從操作子上脫離下來，無CAP-cAMP的輔助，結合在啟動子上的RNA聚合酶也不能啟動轉錄。因此葡萄糖效應又稱代謝阻遏。CAP和cAMP促進了開放的啟動子復合物的形成Lac的調控區：在操縱子的上游啟動子的左側含有激活位點，也叫CAP結合位點Upelement提高ARⅡ的結合效率CAP-cAMPbindingsite(Activatorregion，AR)IR-60

ARⅠ

-40ARⅡ

-50-30-20-10+1-70IRInvertedrepeat（反向重復）ARⅠ是CAP-cAMP的強結合位點（-70~-50）

ARⅡ是CAP-cAMP的弱結合位點（-50~-40）

ARⅠ+CAP-cAMPcooperativeeffect

RNApol

ARII+CAP-cAMP復合體

促使SextamaBox附近GC島區的雙螺旋結構穩定性降低，

PribnowBox的解鏈溫度降低，利于轉錄啟動ARIARIIGCIslandSextamaPribnowNullARII

RNApol.intopribnowBox

BUTtranscriptionoff轉錄關閉RNApolRNApolTheCAP-cAMPcomplexstimulatestranscriptionofLacoperonbybindingtoanactivatorsiteadjacenttothepromoterandhelpingRNApolymerasebindtothepromoterCAP-cAMP復合物通過與啟動子相鄰的激活位點的結合并有助于RNA聚合酶與啟動子的結合，從而促進乳糖操縱元的轉錄。CAP-cAMP

通過蛋白質與蛋白質之間的相互作用與RNA聚合酶的αCTD末端相互作用。CAP-cAMP結合在靶DNA上時使DNA大概彎曲100°。CAP-cAMP二聚體結合到DNA上的激活物結合位點上，RNA聚合酶的α亞基的CTD與CAP蛋白上的特殊位點相互作用，增強了聚合酶和啟動子的結合。RNA聚合酶在CAP的協助下結合到啟動子上，CAP由α-CTD（C端結構域）識別。CAP-cAMP激活乳糖操縱子的假說

Busby,S.andR.H.EbrightCell79:742,1994cAMP與代謝物激活蛋白在大腸桿菌中，cAMP的濃度受到葡萄糖代謝的調節。如果將細菌放在缺乏碳源的培養基中培養，細胞內cAMP的濃度就高。如果在含葡萄糖的培養基中培養，cAMP的濃度就低；如果培養基中只有甘油或乳糖等不進行糖酵解途徑的碳源，cAMP的濃度也會很高。因此推測糖酵解途徑中位于葡萄糖-6-磷酸與甘油之間的某些代謝產物是腺苷酸環化酶的抑制劑。CAP因子是由兩個相同的亞基構成的二聚體。明顯特點是不同操縱子CAP結合位點與轉錄起點的相對位置不同。結合位點位于啟動子內（-41bp），只有一個CAP與DNA結合，并與RNA聚合酶緊密接觸。Gal操縱子。結合位點與啟動子相鄰（-61bp），有兩個CAP與DNA結合，CAP與RNA聚合酶毗鄰。Lac操縱子。結合位點位于啟動子上游（-92bp），有一個CAP與DNA結合，CAP與RNA聚合酶之間有另一個調控蛋白結合。Ara操縱子。理論上CAP激活轉錄有兩種作用方式：直接作用于RNA聚合酶。作用于DNA并改變其結構，以協助RNA聚合酶的結合。cAMP—CAP具有廣泛生理效應的正控制系統存在于多種基因表達調控體系中LacoperonexpressioncAMP(Positive-inducible)

正控誘導lactose(Negative-inducible)

負控誘導

Negative—repressibleoperon(Anabolicenzyme)（Operonstendtobeturnedonbythepresenceofthatsubstance）前面我們介紹的乳糖操縱元是可誘導的負調控，當底物的出現操縱元才具有轉錄活性，編碼的蛋白質是參與分解底物的酶。（Negative—repressibleoperon(Anabolicenzyme)）大腸桿菌基因組還具有可阻遏的負調控操縱元，主要是編碼參與合成代謝的酶類的基因。（Operonstendtobeturnedoffbythepresenceofthatsubstance）由于底物的存在，操縱元是關閉的，因為培養基中含有這種營養物質，生物體沒必要再消耗原材料和能量自己合成這種營養物質。（e.g.tryptophansynthetaseoperon）如大腸桿菌的色氨酸合成酶操縱元。（Igene

inactiverepressor）其調節基因編碼的阻遏物是無活性的，只有當輔阻遏物（色氨酸）存在時，操縱元才被關閉（Co-repressor(tryptophan)。6.3.1.2色氨酸操縱子與負調控阻遏系統它不受葡萄糖或cAMP-CAP的調控。操縱子除了具有阻遏系統以外還有弱化系統。NegativecontrolInactiverepressor

InductionandrepressioncanbeunderpositiveornegativecontrolRepressorInducerInductionCorepressorActiverepressor

Inactiverepressor

RepressionPositivecontrolInactiveactivator

InducerActiveactivator

Activeactivator

Inactiveactivator

Corepressor

Negative—repressibleoperon(Anabolicenzyme)e.g.1tryptophansynthetaseoperon（色氨酸合成操縱子）Igene

inactiverepressor（無活性的阻遏物）Co-repressor(tryptophan，色氨酸)底物的出現操縱子打開；由于信號分子（輔阻遏物）的出現操縱子關閉Ptrp+trpEtrpDtrpCOtrptrpLAttenuatortrpBtrpAtrpRLeaderregiontrpE：鄰氨基苯甲酸合成酶亞基ⅠtrpD：鄰氨基苯甲酸合成酶亞基ⅡtrpC：鄰氨基苯甲酸異構酶;吲哚甘油磷酸合成酶trpB：色氨酸合成酶β亞基trpA：色氨酸合成酶α亞基trpR：產生阻遏物的基因,AporepressormonomertrpL：前導肽色氨酸的合成分五步完成，共有7個基因參與。培養基中色氨酸含量高時，與游離的輔阻遏蛋白結合，并使之與操縱區DNA緊密結合；當培養基中色氨酸供應不足時，輔阻遏物失去色氨酸并從操縱區上解離，操縱子去阻遏。細菌中參與分枝酸代謝的主要酶系大腸桿菌中的trp操縱子1.鄰氨基苯甲酸合酶（包括ADIC合酶合ADIC裂解酶）；2.ADC合酶，ADC裂解酶；3.異構分枝酸合酶；4.分枝酸裂解酶trpR基因產物被稱為阻遏物蛋白前體，無活性。該基因的突變常常引起trpmRNA的組成型表達。此系統中的效應物分子是色氨酸。除非培養基中有色氨酸，否則這個阻遏蛋白不會與操縱區結合。阻遏蛋白與色氨酸相結合形成有活性的阻遏物，才會與操縱區結合，從而關閉trpmRNA的轉錄。當培養基中的色氨酸含量較高時，與游離的輔阻遏蛋白結合，并使之與操縱區的DNA緊密結合；當培養基中的色氨酸供應不足時，輔阻遏物失去色氨酸并從操縱區上解離，色氨酸操縱子去阻遏。OperatoroperononoperonoffRepressor+trpactiverepressorInactiverepressorPtrp+trpEtrpDtrpCOtrptrpBtrpAtrpRPtrp+trpEtrpDtrpCOtrptrpBtrpAtrpRtryptophanRepressor(inactive)cannotbindontheOsite(trpabsent)discovery●

E.colitrpsynthetaseoperon(

C.YanofskystanfordUniv.)Negative-repressibleoperon負阻遏操縱子與完全沒有阻遏物時相比，可以使阻遏的效率上升70倍。IPOleadingseq.EDCBAtrp+●1968.ImamatoLab.當trp水平較低時，RNApol移動但是在L.S.處脫落，結構基因停止轉錄。IPOleadingseq.EDCBALowtrp+thecomplexcannotbindwiththeOsite●1975ImamatoLab.E.colitrp-AARS(t.s，溫度敏感型突變體，42℃不能負載色氨酸)w.t.30℃trpEt.s.mut.42℃trpELowtrp，operonopen培養在Trp含量低的培養基上檢測操縱子中trpE的表達活性TrptRNAtrp30℃42℃t.s.(42℃)t.s.(30℃)w.t.(30℃)

w.t.(42℃)trpEWhy?AARS

t.s.(42℃)AARSinactive

notrp-tRNAtrpsynthesis

RNApolmovepastL.S

transcriptoftrpE(Eenzymelevelishigh）

t.s.(30℃),w.t.(30℃),(42℃)AARSactivesynthesizetrp-tRNAtrpRNApolbreakoffatL.S.notranscriptionoftrpE

（Eenzymelevelislow）Conclusion:---Whentrpand/ortrp-tRNAtrp

existincells,thereisnosynthesisoftrp---t.s.(42℃)noAARSandtrp-tRNAtrp,（initiatethetranscriptionoftrpsynthetaseRNA)---trp-tRNAtrp

isthemainfactorleadingtoRNApol.falling

offatL.S.TheprimarystructureoftrpoperonRNA在trpmRNA5’端trpE基因的起始密碼前有一個長162bP的mRNA片段被稱為前導區。其中123-150位堿基序列如果缺失，trp基因表達可提高6-10倍。研究發現，當mRNA合成起始以后，除非培養基中完全沒有色氨酸，轉錄總是在這個區域終止，產生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉錄，這就是123-150區序列缺失會提高trp基因表達的原因。在trpmRNA5’端trpE基因的起始密碼前有一個長162bP的mRNA片段被稱為前導區，其中123-150位堿基序列如果缺失，trp基因表達可提高6-10倍。研究發現，當mRNA合成起始以后，除非培養基中完全沒有色氨酸，轉錄總是在這個區域終止，產生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉錄，這就是123-150區序列缺失會提高trp基因表達的原因。因為轉錄終止發生在這一區域，并且這種終止是被調節的，這個區域就被稱為弱化子。研究引起終止的mRNA堿基序列發現該區mRNA通過自我配對可以形成莖-環結構，有典型的終止子特點。這種調控機制就是弱化作用（attenuation）。事實上，阻遏機制對色氨酸來說是一個一級開關，主管轉錄是否啟動，相當于trp操縱子的粗調開關。trp操縱子中的弱化子系統進行細調控，決定已經啟動的轉錄是否繼續下去。這個細微調控是通過轉錄達到第一個結構基因之前的過早終止來實現的，細胞中色氨酸的濃度是實現過早終止的根本原因。TheprimarystructureoftrpoperonRNA

60~68—75~83&110~121—126~134(palindromicseq.),poly(U)27—68base

ORFof14aa140baseRNAalmostbindingwithprotein(translableseq.)trphighfrequencywith2/14in14aa前導肽弱化作用需要負載tRNAtrp參與，這說明前導序列的某些部分被翻譯了。前導序列包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA；如果翻譯起始于AUG，應該產生一個含有14個氨基酸的多肽。前導序列具有一個非常有意義的特點：在第10和第11位上有相鄰的兩個色氨酸密碼子。這一點很重要，因為組氨酸操縱子中，也具有弱化子，也具有一個類似的能編碼前導肽的堿基序列，此序列中含有7個相鄰的組氨酸密碼子。苯丙氨酸操縱子中同樣存在弱化子結構，其前導序列中也有7個苯丙氨酸密碼子。這些密碼子參與了操縱子中的轉錄弱化機制。(7/16)(7/16)(8/15)RegulatorycomponentsofthetrpLregionmRNA前導區的序列分析trp前導區的堿基序列中4個分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進行堿基配對，有時以1-2和3-4配對，有時只以2-3方式互補配對。RNaseTl降解實驗(此酶不能水解配對的RNA)表明，純化的trp前導序列中確有1--2和3--4的配對方式，由此定位的3--4配對區正好位于終止子的識別區，當這個區域發生破壞自我配對的堿基突變時有利于轉錄的繼續進行。衰減子調控機制是控制RNA聚合酶通讀衰減子的能力。通過細胞內是否存在已經負載氨基酸的氨酰tRNA，調節內部終止子發夾結構的形成。轉錄弱化作用轉錄的弱化理論認為mRNA轉錄的終止是通過前導肽基因的翻譯來調節的。因為在前導肽基因中有兩個相鄰的色氨酸密碼子，所以這個前導肽的翻譯必定對tRNAtrp的濃度敏感。當培養基中色氨酸的濃度很低時，負載有色氨酸的tRNAtrp也就少，這樣翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就會很慢，當4區被轉錄完成時，核糖體才進行到1區(或停留在兩個相鄰的Trp密碼子處)，這時的前導區結構是2—3配對，不形成3--4配對的終止結構，所以轉錄可繼續進行，直到將結構基因轉錄。當培養基中色氨酸的濃度很高時，核糖體可以順利的通過兩個相鄰色氨酸密碼子，在4區被轉錄之前，核糖體就到達2區，這樣致使2-3不能配對，3-4區可以自由配對形成莖環結構狀終止結構，轉錄停止。所以弱化子對RNA聚合酶的影響依賴于前導肽翻譯中核糖體所處的位置。Trp(Arg)starvedNon-starvedRibosomepassthrough

TrpcodonUUUUUU1234核糖體通過Trp密碼子，占據1和2序列，轉錄形成的3和4可以形成發夾結構，阻止轉錄的進行，轉錄停止，出現弱化作用。RibosomepausingatTrpcodon1423核糖體停留在Trp密碼子處，此時沒有足夠的Trp，核糖體停留于此，此時轉錄出來的2和3形成發夾結構，RNA聚合酶轉錄出來的4沒有和3形成終止子的機會，RNA聚合酶繼續向下移動，轉錄結構基因，此時不表現出抑制作用。tRNAtrp+AARStrptrp-tRNAtrpProteinsynthesisTrpsynthetaseopron

IPOL.SEDCBAThetrpoperonofE.coliIntryptophan-poormediumIntryptophan-richmedium細菌通過弱化作用彌補阻遏作用的不足，因為阻遏作用只能使轉錄不起始，對于已經起始的轉錄，只能通過弱化作用使之中途停頓下來。阻遏作用的信號是細胞內色氨酸的多少，弱化作用的信號則是細胞內載有色氨酸的tRNA的多少。它通過前導肽的翻譯來控制轉錄的進行，在細菌細胞內這兩種作用相輔相成，體現著生物體內周密的調控作用。細菌中為什么需要有弱化子系統呢?一般認為，阻遏物從有活性向無活性的轉變速度較慢，需要有一個能更快地做出反應的系統，以保持培養基中適當的色氨酸水平。弱化子能較快地通過抗終止的方法來增加基因表達，迅速提高內源色氨酸濃度。那么，為什么還要有阻遏體系呢?沒有阻遏體系，似乎只有弱化也可以調節色氨酸酶系的合成。目前認為阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在時，阻止非必需的先導mRNA的合成，它使這個合成系統更加經濟。事實上，自然界中存在著不同類型的合成體系。組氨酸操縱子擁有在功能上與操縱子完全相同的弱化子結構，但沒有阻遏物，它的表達完全受弱化子調節。6.3.1.3其他操縱子

(1)半乳糖操縱子

大腸桿菌半乳糖操縱子（galactoseoperon）包括3個結構基因,異構酶(galE)/乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉移酶(galT)/半乳糖激酶(galk)。這3個酶的作用是使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。半乳糖操縱子的調節基因是galR。galR與結構基因及操縱區O等的距離都很遠，而galR產物對galO的作用與lacl-lacO的作用相同。gal操縱子的誘導物主要是半乳糖。目前為止gal阻遏蛋白的作用機理還不清楚.此外，gal操縱子還有兩個特點：①它有兩個啟動子，其mRNA可從兩個不同的起始點開始轉錄；②它有兩個O區，一個在P區上游-67—-73，另一個在結構基因galE內部。gal操縱子、lac操縱子和ara操縱子的結構及其代謝途徑cAMP-CRP對gal啟動子的作用

gal操縱子P-O區的堿基序列有兩個相距僅為5bp的啟動子，gal操縱子可以從兩個啟動子分別起始基因轉錄，每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結合位點Sl和S2。cAMP-CRP對從S1和S2起始的轉錄有不同的作用。從S1起始的轉錄只有在培養基中無葡萄糖時才能順利進行，RNA聚合酶與Sl的結合需要半乳糖、CAP和較高濃度的cAMP。體外轉錄的實驗證明，cAMP-CAP能夠刺激gal操縱子從S1的轉錄，cAMP-CAP抑制從S2的轉錄。當有cAMP-CAP時，轉錄從S1開始，當無cAMP-CAP時，轉錄從S2開始。從S2起始的轉錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CRP能抑制由這個啟動子起始的轉錄，因此，cAMP-CRP在gal操縱子中所起的調節作用比在lac操縱子中更為復雜。一般認為，cAMP-CRP有利于RNA聚合酶-S1區復合物形成開鏈構象，從而起始基因轉錄。同時，由于S1和S2區的核苷酸部分重疊，這一復合物的存在干擾了RNA聚合酶-S2復合物的形成，抑制S2起始的基因轉錄。雙啟動子的生理功能

為什么gal操縱子需要兩個轉錄起始位點?這與半乳糖在細胞代謝中的雙重功能有關。半乳糖不僅可以作為惟一碳源供細胞生長，而且與之相關的物質——尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細胞壁合成的前體。生長過程中細胞必須隨時合成相應的酶，以保證UDPgal的供應。在沒有外源半乳糖的情況下，細胞通過半乳糖差向異構酶的作用由UDP—葡萄糖合成UDPgal。因為合成細胞壁過程中對異構酶的需要量很小，本底水平的組成型合成就能夠滿足生理需要。顯然此mRNA是在沒有半乳糖的情況下合成的。如果只有S1一個啟動子，由于這個啟動子的活性依賴cAMP-CAP，當培養基中有葡萄糖時就不能合成異構酶。假如只有啟動子S2，在沒有葡萄糖存在有半乳糖存在時，細菌不能利用半乳糖，就算本底水平的合成也被阻遏了。所以，無論從必要性或經濟性考慮，都需要一個不依賴于cAMP-CAP的S2啟動子進行本底水平的組成型合成，以及一個依賴于cAMP-CRP的S1啟動子對高水平合成進行調節。（2）阿拉伯糖操縱子阿拉伯糖(arabinose)是另一個可以為代謝提供碳源的五碳糖。在大腸桿菌中阿拉伯糖的降解需要3個基因：araB、araA和araD，它們形成一個基因簇，簡寫為araBAD。araBAD相鄰的是一個復合的啟動子區域、兩個操縱區（Ol，O2）和一個調節基因araC。AraC蛋白同時顯示正、負調節因子的功能。araBAD和araC基因的轉錄是分別在兩條鏈上以相反的方向進行的。caparaIaraBaraA

araDaraO2araO1araC存在兩個操作子位點araO1和araO2

Theara

Operon//阿拉伯糖操縱元第一個操縱子araO1控制調控基因araC的轉錄活性，第二個操縱子araO2位于其控制的基因PBAD啟動子的遠上游的位置TheCAP-bindingsiteisabout200bpupstreamof

arapromoter.CAP結合位點在PBAD的上游約200bp處。Theoperonhassystemofnegativeregulation,mediatedbytheAraCprotein.阿拉伯糖操縱元具有由AraC蛋白介導的負調控系統IsomerasearaA編碼異構酶（Isomerase）催化L-阿拉伯糖（L-Arabinose）形成L-核酮糖（L-Ribulose）；araB編碼L-核酮糖激酶（L-Ribulokinase）催化L-核酮糖（L-Ribulose）形成L-5-磷酸核酮糖（L-Ribulose-5-P）；araD編碼L-5-磷酸核酮糖差向異構酶（L-Ribulose-5-Pepimerase）催化L-5-磷酸核酮糖（L-Ribulose-5-P）形成D-5-磷酸木酮糖（D-Xylulose-5-P）阿拉伯糖操縱元的調控蛋白AraC具有雙重效應，即可以作為正調控蛋白又可以作為負調控蛋白，其在操縱元上具有三個結合位點：araO2,araO1,andaraI.CAPsitearaI

araB

araA

araDaraO2araO1araCPCPBADAraCL-ArabinoseL-RibuloseL-RibulokinaseL-Ribulose-5-PATPA