免疫熒光和免疫組化問題如下：免疫熒光好還是做免疫組化好？我傾向于做免疫組化，但老板傾向做熒光，我想兩種方法都了解一下，能否介紹一下兩種方法的詳細(xì)步驟（protocol）。—抗、二抗抗體（包括熒光抗體）如何選擇，哪個(gè)公司的比較好？濃度怎么掌握？其實(shí)IHC和IFC本質(zhì)都是一樣的。只是最后的顯色方法不一樣，IHC是用酶加底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，用普通光鏡觀察；IFC是直接用帶有熒光物質(zhì)連接的二抗與一抗結(jié)合，在相應(yīng)波長的激發(fā)光下觀察。我也傾向于IHC,理由如下：IHC的級聯(lián)放大作用使得抗原比較少的組織也能有很強(qiáng)的著色。我一般用Vector公司的Elite系列ABCkit,HRP-DAB顯色系統(tǒng)。IHC的切片可以長期保存。很多時(shí)候試驗(yàn)做出來了，需要反復(fù)的看片子。而IFC的有熒光猝滅，無法長久保存。所以不利于反復(fù)閱片。IFC有利于做MultipleLabeling，比如在同一location的兩種或多種抗原的比較，通常用IFC;IFC還多用于活細(xì)胞的staining，但如果是石蠟切片，總會有一些自發(fā)熒光現(xiàn)象存在。所以個(gè)人認(rèn)為，能用IHC的時(shí)候建議不用IFC。詳細(xì)protocol請?jiān)诒景鎯?nèi)search—下，已經(jīng)有很多的討論了。一抗通常買DAKO、SIGMA、VECTOR,二抗可以選擇相應(yīng)公司的，也可以買SANTACRUZ的，比較便宜一些。熒光二抗建議買

MolecularProbe的，現(xiàn)在和Invitrogen合并了。濃度先參考datasheet上的，不過還是自己要optimize—下，比如建立個(gè)濃度梯度。陰性對照用相同種屬來源動物的IgG。供參考。GOODLUCK!免疫熒光結(jié)果分析及抗體選擇一一許多問題你思考過嗎？http://www.dxy.cn/bbs/topic/24548838?keywords=%E5%85%8D%E7%96%AB%E8%8D%A7%E5%85%89%E7%BB%93%E6%9E%9C%E8%83%BD%E4%BB%A3%E6%9B%BF%E5%85%8D%E7%96%AB%E7%BB%84%E5%8C%96%E5%90%97免疫熒光因其直觀、色彩鮮明而被廣泛用于檢測各種蛋白的定位表達(dá)。（1）免疫單標(biāo)此時(shí)與免疫組化的用途相近，僅能檢測待測蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)部位，如細(xì)胞核，細(xì)胞漿及細(xì)胞膜。疑問：許多蛋白既在細(xì)胞核又在細(xì)胞漿表達(dá)，某蛋白活性發(fā)生變化后主要表現(xiàn)在該蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞漿存在表達(dá)量的差異（如NF-KB/ERK等）。因此某些實(shí)驗(yàn)的研究目的就是觀察某種干預(yù)后這些蛋白是否存在活性的變化。針對這種細(xì)胞核和細(xì)胞漿均存在蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，單一的免疫熒光是否能說明問題，是否需要DAPI染色協(xié)助說明該蛋白的細(xì)胞定位？此時(shí)會出現(xiàn)多種可能,（1）兩種染色不重合（不同細(xì)胞分別染色）；（2）兩種染色重合但不疊加（同一細(xì)胞分別在細(xì)胞核DAPI染色和細(xì)胞漿待測蛋白染色）；（3）兩種染色疊加

（同一細(xì)胞同時(shí)在細(xì)胞核兩種染色）；（4）兩種染色重合且疊加（同一細(xì)胞細(xì)胞核DAPI染色及待測蛋白細(xì)胞核及細(xì)胞漿染色）。此時(shí)DAPI染色是否有這個(gè)必要。（2）免疫雙標(biāo)很多情況下，某一蛋白在同一樣本同一組織不同的細(xì)胞系表達(dá)，如腦組織中的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)。為了觀察某一蛋白的表達(dá)變化，設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)需要進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色，除了明確蛋白的結(jié)構(gòu)定位（細(xì)胞核、細(xì)胞漿及細(xì)胞膜）還要進(jìn)行細(xì)胞定位。疑問：如何選擇細(xì)胞標(biāo)記物，如神經(jīng)元有NeuN（細(xì)胞核）、NSE（細(xì)胞漿）、MAP-2（胞漿及軸突），但推測待測蛋白在神經(jīng)元的細(xì)胞核表達(dá)，需要選擇神經(jīng)元的標(biāo)記物為NeuN（細(xì)胞核）還是其他，結(jié)果如何分析。以上疑問困惑很久，以前只知道盲目實(shí)驗(yàn)，論文寫作過程中才發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)很多問題，而且也經(jīng)常被審稿老師追問，希望各位老師及戰(zhàn)友分享自己的經(jīng)驗(yàn)，大家共同提高！（1）我以為，IF能提供一種形態(tài)學(xué)上的translocation的趨勢的證明，如很多beta-catenin的研究都會用到IF以證明其轉(zhuǎn)入胞核中，而其中，我所見的絕大部分都沒有用到DAPI。因?yàn)閱稳镜男Ч苊黠@，空的圓圈肯定是胞核嘛。不染DAPI的效果已經(jīng)足夠好。即使染了，也不宜converge，因?yàn)镈API會掩蓋胞核的beta-catenin熒光信號，也只能平行放一張證明那個(gè)空圈是胞核，其實(shí)這樣就意義不大了。我想這是很多人沒有染/展示DAPI的原因。當(dāng)然，如果要進(jìn)一步說明問題，還是分別提胞漿和胞核的蛋白，分別作WB以定量的好。TF的可以直接做EMSA。

（2）“為了觀察某一蛋白的表達(dá)變化，設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)需要進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色”用IF來說明蛋白的表達(dá)變化，實(shí)在是不靠譜，熒光強(qiáng)度的影響因素太多了。IF只是提供定位而已。雙標(biāo)marker選擇的話，核marker和胞漿marker其實(shí)都可以的。具體是看converge后，能否很好地標(biāo)示出兩種抗體都是染在同一個(gè)細(xì)胞上。如果用NeuN，沒有胞漿形態(tài)，似乎不太好看，但是有沒有double到就看得很明顯。MAP-2的話，有時(shí)候染色效果不好，難以分辨出單個(gè)細(xì)胞，需要費(fèi)點(diǎn)勁挑出典型的double的細(xì)胞。但如果染得好，效果就很漂亮了。當(dāng)然，提供共聚焦的三維圖片是更好了。但是，如果二維圖片很典型的話，一般是認(rèn)可的。某些完全在胞漿表達(dá)的蛋白如果染色成功，的確能清晰看到空的圓圈（為未染色的完整的細(xì)胞核），如果加染DAPI僅僅是使胞漿和胞核重合，converge后看到一個(gè)完整的細(xì)胞，對分析意義不大。某些蛋白既可在胞漿又可在胞核，單染后同樣可能在胞體中間發(fā)現(xiàn)不規(guī)則的空圈，此時(shí)主觀的判斷表達(dá)部位，容易被審稿老師提問，要求DAPI進(jìn)行參考定位（這就是發(fā)帖判斷這種要求是否科學(xué)的緣由）。（2）雙標(biāo)marker選擇的話，核marker和胞漿marker其實(shí)都可以的。具體是看converge后，能否很好地標(biāo)示出兩種抗體都是染在同一個(gè)細(xì)胞上。如果用NeuN，沒有胞漿形態(tài)，似乎不太好看，但是有沒有double到就看得很明顯。MAP-2的話，有時(shí)候染色效果不好，難以分辨出單個(gè)細(xì)胞，需要費(fèi)點(diǎn)勁挑出典型的double的細(xì)胞。但如果染得好，效果就很漂亮了。當(dāng)然，提供共聚焦的三維圖片是更好了。但是，如果二維圖片很典型的話，一般是認(rèn)可的。至于選何種marker，—直不知道選擇的標(biāo)準(zhǔn)，如果是根據(jù)converge后，能否觀察兩種抗體都在一個(gè)細(xì)胞上，我認(rèn)為各種marker都是可以選擇的。

（3）用肝來說明蛋白的表達(dá)變化，實(shí)在是不靠譜，熒光強(qiáng)度的影響因素太多了°IF只是提供定位而已。完全贊同以上觀點(diǎn)，我的理解免疫熒光實(shí)際只能回答有或無及在哪里。經(jīng)常看到這樣的文獻(xiàn)探討某一干預(yù)措施對X蛋白表達(dá)的影響。將研究對象分為正常組、模型組、不同劑量干預(yù)組，然后均采用免疫雙標(biāo)觀察此蛋白在各組中的表達(dá)，這樣的設(shè)計(jì)是否合理？（此處不討論WB定量），有無必要？如何設(shè)計(jì)免疫熒光的檢測？免疫熒光抗體能用于免疫組化嗎？因某公司只有用于免疫熒光的抗體，但我要做免疫組化。可以用嗎？/bbs/topic/12680657?keywords=%E5%85%8D%E7%96%AB%E8%8D%A7%E5%85%89%20%20%E8%83%BD%E4%BB%A3%E6%9B%BF%E5%85%8D%E7%96%AB%E7%BB%84%E5%8C%96%E5%90%97免疫熒光和免疫組化使用的切片一般都不同，一個(gè)是冰凍切片，—個(gè)是石蠟切片，所以切片上面的目的蛋白的修飾程度都不一樣，所以很多情況下是不能通用的。你想如果都能通用，哪個(gè)公司的抗體說明書上還區(qū)別IF和IHC啊，全都寫上不是更好！所以選擇抗體一定要在用途那一欄找到自己需要的具體用途。santa的那種抗體，還是做個(gè)IF試試吧，不行最起碼還可以投訴，沒準(zhǔn)還可以更換一支，做IHC做不出來根本沒有投訴的可能。祝好運(yùn)!原理其實(shí)是一樣的，最好做冰凍切片石蠟切片照樣可以做免疫熒光的，只不過需要抗原修復(fù)，盡量不要用H2O2阻斷（據(jù)軍科院的老教授說會減弱熒光顯色）可以用于免疫熒光的抗體當(dāng)然可以用于免疫組化，前面的原理都是一樣的，只不過二抗一個(gè)選的是辣根酶標(biāo)記的，一個(gè)是熒光素標(biāo)記的，當(dāng)然免疫組化跟免疫熒光所需的條件不同，需要重新摸索適當(dāng)?shù)臐舛缺壤绻庖邿晒庾龀鰜砹耍f明一抗可以和目的蛋白結(jié)合，二抗跟—抗結(jié)合也沒問題，那么免疫組化做不出就可以懷疑是二抗問題了

當(dāng)然還有一個(gè)極端情況，就是免疫熒光看到的就不是目的蛋白而是自發(fā)熒光，那么就是一抗問題了1上面的帖子讓我學(xué)習(xí)了很多。我們實(shí)驗(yàn)室因?yàn)槭炃衅龅亩啵允炃衅瑸槔Ｈ绻庖呓M化能做出來，免疫熒光基本是能做出來的，因?yàn)樵砘疽恢拢庖邿晒獗让庖呓M化要敏感。一般來說大公司的一抗寫著可以做免疫組化，那基本都是能做的出來的，如果只是寫著免疫熒光，沒寫免疫組化，你寫信咨詢一般得到的答案是，沒有做過(石蠟切片)的免疫組化，不建議使用，其實(shí)是在推卸你萬一做不出的責(zé)任。其實(shí)結(jié)果就是可能做的出，也有可能做不出。我們實(shí)驗(yàn)室的人做出來過只標(biāo)著IF，沒標(biāo)IHC的，做出了IHC。2對panmo2006戰(zhàn)友所說的自己深感興趣，特的找了以metalcolin戰(zhàn)友所說的santacruz抗體為例，我以MCP-1抗體為例。現(xiàn)在去查santacruzMCP-1抗體官網(wǎng)基本查不到I可以做IHC，免疫熒光一般都是可以的(也不能排除我查找的資料不全，因?yàn)橛行┪墨I(xiàn)，特別是國內(nèi)的文獻(xiàn)抗體貨號是不給出的，而且抗體的資料也都是在變化)。《單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)MCP-1的表達(dá)及其意義》歐陽春，寧建平，周巧玲-中南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004;《MCP-1和VEGF在膀胱癌中表達(dá)的相關(guān)性及其意義》胡毅，關(guān)桂梅，孔祥波，董震-中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2006。在這2篇國內(nèi)文獻(xiàn)都是提到了santacruz的MCP-1抗體做免疫組化。另外一篇國外文獻(xiàn)JReprodImmunol.2003Dec;60(2):143-57《Monocytechemoattractantprotein-1(MCP-1/CCL2)inexperimentalautoimmuneorchitis》也是santacruzMCP-1抗體做免疫組化。貨號是SC-1785，在官網(wǎng)上可以查到是用于WB,IP,IF,SiRNA。但是他這里還是用用免疫組化，并有照片，在Page9Fig4圖A-C。小子愚見，敬請高手指教。

【求助】關(guān)于免疫熒光和免疫組化的優(yōu)劣http://www.dxy.cn/bbs/topic/12389953?keywords=%E5%85%8D%E7%96%AB%E8%8D%A7%E5%85%89%20%20%E8%83%BD%E4%BB%A3%E6%9B%BF%E5%85%8D%E7%96%AB%E7%BB%84%E5%8C%96%E5%90%97剛開始做免疫學(xué)的實(shí)驗(yàn)，有個(gè)問題想請教各位大俠啊！免疫組化（石蠟切片）和免疫熒光的優(yōu)劣如何比較？我是想檢測三種物質(zhì)的表達(dá)水平改變，同時(shí)分析三者改變是否具有相關(guān)性，想做熒光，老板說最有一步如何定量測定？我也搞不清楚了。現(xiàn)在很急了，請各位指教啊！非常感謝！定量可能要做WESTERN吧，做免疫熒光，免疫組化，都是只能大概的量，好像不能定量吧，這個(gè)是我的看法。不知道是否正確，請各位高手批評指正。我的觀點(diǎn)如下：1、 一般蛋白表達(dá)定量的方法最好用ELISA、RIA和Westernblotting等，免疫組化和免疫熒光在定性和定位上很有優(yōu)勢，當(dāng)然，你的片子做得很好（特異性染色強(qiáng)而非特異性染色淺），可以相對半定量蛋白表達(dá)，但拍照一定要在相同條件下（成像系統(tǒng)中的參數(shù)設(shè)置）。2、 免疫組織化學(xué)和免疫熒光的區(qū)別：（1） 原理方面：前者是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行測定的技術(shù)。而后者是采用熒光素標(biāo)記的已知抗體（或抗原）作為探針，檢測待測組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復(fù)合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下直接觀察；（2） 標(biāo)本制作：免疫熒光一般用冰凍切片，最好用新鮮組織；而酶免疫組化用石蠟切片或冰凍切片均可以。（3） 實(shí)驗(yàn)方法：免疫熒光染色步驟簡單，而酶免疫組化方法較為復(fù)雜，多了DAB顯色過程和抗原修復(fù)、脫蠟過程等。（4）染色后的標(biāo)本保存：免疫熒光染色后的標(biāo)本一般短時(shí)間內(nèi)有效，時(shí)間長了熒光可能衰退；而酶免疫組化染色標(biāo)本可以長期保存。（5）實(shí)驗(yàn)條件：免疫熒光要求較高，實(shí)驗(yàn)室最好有熒光顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡更好；而酶免疫組化要求較低，只需普通光學(xué)顯微鏡即可。我的觀點(diǎn)是:1、免疫熒光一般用新鮮組織的冰凍切片，效果很好，但避免反復(fù)凍融組織，否則抗原彌散和祖先細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞；而石蠟切片一般用免疫組化的方法較好。但有人說國外現(xiàn)在有些實(shí)驗(yàn)室也用石蠟切片做免疫組化，前提是有高質(zhì)量的一抗和熒光素標(biāo)記的二抗等優(yōu)良條件。2、 如果做定位，且只要你的抗體可以做IHC/IF，那我認(rèn)為可以用免疫組化的方法做緩激肽（Bradykinin）在爬行動物生殖腺中的定位。3、 最后，我覺得你要抉擇免疫組化和免疫熒光？如果是胞膜蛋白，建議用冰凍切片做免疫熒光分析，前提是組織新鮮取材，否則抗原彌散嚴(yán)重；如果是胞漿或胞核蛋白，可以用石蠟切片的免疫組化方法，只要你的抗體能夠做石蠟切片免疫組化和適當(dāng)?shù)奈⒉ㄐ迯?fù)，效果還是可以的。4、 石蠟切片的優(yōu)勢在于組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存完整，但對抗原的損傷較大，尤其醛基對抗原決定族的封閉作用；而冰凍切片對抗原的保真較好，但反復(fù)凍融的組織切片，組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不完好，進(jìn)而影響定位。biancheng2007wrote:謝謝！因?yàn)槲业膶?shí)驗(yàn)樣品都不是新鮮的，都是早已取好，保存在4度，70%酒精中的，所以只能做石蠟切片。關(guān)于抗體的問題，我很想知道如何選擇抗體？買的抗體一般是能做免疫熒光的，但是我怕不能做出，因?yàn)橘I的基本都是來源于哺乳動物的，我想做的是爬行動物的!1.抗體選擇要求和原則：1)選擇單克隆還是多克隆抗體？前者特異性好，但靈敏度差；而后者靈敏度好，但特異性稍差。我喜歡選擇多克隆抗體，供參考。2)選擇何種種屬來源？這主要與你的二抗來源有關(guān)，若選擇兔來源的，那二抗就是羊抗兔或鼠抗兔；一般兔來源的多是多克隆；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。3)更重要的是能檢測何種種屬的抗原，即