基于大豆蛋白的白腐真菌發酵產乳酸工藝研究

大豆來源廣泛，營養成分豐富。大豆蛋白具有降低血液中的低密度脂蛋白,減少身體內鈣的損失等重要生理功能。中國傳統腐乳是大豆蛋白經凝結后再由微生物降解改變內在蛋白質空間網絡結構而成的具有豐富營養價值和獨特質地及風味的大豆加工產品。腐乳發酵成熟過程實質上就是大豆蛋白質的酶促降解過程。腐乳作為歷史悠久的民族食品,已形成一定規模的工業化生產,但高鹽化和發酵周期過長問題已阻礙了其發展。本研究借鑒西餐涂抹型干酪的產品形態,旨在研究可用于良好涂抹性和延展性膏狀腐乳醬,將現代酶工程技術應用于大豆蛋白降解過程,生產低鹽、方便、質量均一的腐乳醬,大大縮短了生產周期。通過探討酶制劑、食鹽、酒精等因子對腐乳醬中氨基酸態氮含量的影響情況,研究了腐乳醬酶促加速成熟過程,為腐乳醬的快速工業化生產奠定了實驗室基礎。1材料和方法1.1菌種、培養基和淀粉大豆、食鹽、白酒:市售;卡地干酪青霉:P.camemberti,天津科技大學微生物實驗室保藏菌種;復合蛋白酶:濟寧耐特食品有限公司;卡拉膠:喬富食品工業有限公司;變性淀粉:天津市頂峰淀粉有限公司;焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉均為食品級。1.2精密科學檢測儀器AB204-N型電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司);pHB-1型數字式pH計(上海精密科學儀器有限公司);索氏提取器(天津玻璃儀器廠);GC-MS-4000氣相色譜-質譜聯用儀(美國VARIAN公司);TA-XTPlus質構儀(英國TextureAnalyzer公司)等。1.3實驗方法1.3.1工藝1.3.2操作要點(1)豆奶制備將適量大豆磨漿。(2)初步發酵將豆乳滅菌后冷卻至室溫,接入霉菌發酵。(3)酶促蛋白分解前期發酵結束后,加入適量的酶制劑和輔料,混合均勻,調節溫度至酶反應溫度,水解一定時間。(4)添加焦磷酸鈉、變性淀粉、卡拉膠加入質量濃度為0.03%的六偏磷酸鈉、0.40%的焦磷酸鈉、3.5%的變性淀粉、0.8%的卡拉膠,攪拌混勻,加熱至適當溫度,保溫20min使酶喪失活力。(5)包裝可以將咖喱等調味料加入調質后的腐乳醬中,調配成不同的口味再包裝,即得成品。1.3.3酶解溫度和時間在預實驗的基礎上,確定影響豆乳中蛋白質水解程度的5個因素的基本參數為:固形物含量13%,蛋白酶用量2.0%,NaCl含量4%,酒精含量3%(均為質量濃度),酶解溫度50℃。分別變動基本參數中的單一因素,檢測相應條件下的氨基酸態氮含量。1.3.4正交實驗設計單因素實驗基礎上,以固形物含量、蛋白酶用量、酶解溫度為主要考察因素,采用L9(34)表做正交實驗,實驗因素水平設計見表1,以氨基酸態氮和產品感官評價為指標。參照文獻,設定感官評分標準(表2),組織有食品專業背景和感官評定經驗的10人對產品參考表2進行感官評定。1.3.5后期成熟時間對豆蛋白分解過程的影響分別于后期發酵第1、2、3、4、5、6、7、8天時檢測相應條件下的氨基酸態氮含量,考察成熟時間變化對腐乳醬中氨基酸態氮含量的影響。1.3.6酶溫度的選擇分別于70、80、90、95、100℃調質滅酶,然后立即包裝,靜置1W后觀察。1.3.7氨基酸態氮、粗質構、儀器水分:常壓烘箱干燥法;總酸:酸堿中和滴定法;氨基酸態氮:甲醛滴定法;粗脂肪:索氏抽提法;食鹽:AgNO3滴定法(NaCl含量計);質構:TA-XTPlus質構儀;風味:GC-MS。2結果與討論2.1酶促進和分解條件對豆蛋白分解過程的影響2.1.1水解液中氨基酸態氮含量的影響當固形物含量很小時酶還未被底物所飽和,隨著固形物含量的增加,氨基酸態氮含量也不斷增多。當固形物含量達到相當高的程度時,豆乳水解液中的酶已經全部被底物飽和,此時水解液中再也沒有多余的酶,雖增加固形物含量氨基酸態氮含量也不會有所增加。本實驗研究了不同的固形物含量對氨基酸態氮含量的影響,結果如圖1所示。結果表明,當固形物含量在11%~13%時,氨基酸態氮含量增長的幅度較大;>13%時,氨基酸態氮含量緩慢下降。表明高固形物含量有利于酶解反應進行,但同時又會造成水解液黏度增大,影響蛋白酶的擴散,降低水分活度,對酶解反應有抑制作用。因此在保證有較高的氨基酸態氮含量的情況下,選擇固形物含量為13%作為蛋白酶作用的固形物含量條件。2.1.2蛋白酶的用量本實驗對不同蛋白酶用量下的氨基酸態氮含量進行測定,結果如圖2。結果表明,當不添加蛋白酶時,經過一段時間的后期發酵,氨基酸態氮水平沒有顯著提高,由此可以看出,蛋白酶對于大豆蛋白確實有促進降解的作用。添加蛋白酶后,在蛋白酶用量<1.5%時,隨著酶用量的增加,氨基酸態氮含量的增加幅度較小,當蛋白酶濃度繼續升高時,氨基酸態氮含量的增長速度開始上升;但是蛋白酶用量>2.0%時,氨基酸態氮含量已經基本持平,這說明此時的酶含量己經達到飽和,酶反應受到產物的抑制,繼續增加蛋白酶不能達到顯著提高氨基酸態氮含量的目的。所以,蛋白酶用量控制在2.0%為宜。2.1.3溫度和時間對氨基酸態氮含量的影響本實驗研究了不同的酶解溫度對氨基酸態氮含量的影響,結果如圖3所示。結果表明,在40~50℃,氨基酸態氮含量隨溫度的升高呈現明顯的上升趨勢,50℃時氨基酸態氮含量可以達到0.63%。高于50℃,氨基酸態氮含量迅速下降,至60℃后維持在一個較低水平。因此,40~50℃是酶解反應的適宜作用溫度。2.1.4不同食鹽濃度對蛋白酶耐鹽性的影響腐乳醬生產過程中食鹽對氨基酸態氮含量的影響表現在食鹽含量低的蛋白質水解較快,氨基酸態氮的增長較快;食鹽含量高的,則相反。本實驗研究了NaCl對氨基酸態氮含量的影響,結果見圖4。結果表明,當食鹽濃度低于4%時,氨基酸態氮含量變化不很明顯,維持在一個較高的水平,當食鹽濃度>4%時,氨基酸態氮含量才出現明顯降低的趨勢。因此,在一個比較寬的范圍內,蛋白酶具有比較好的耐鹽性。適當的鹽濃度能夠抑制有害微生物的生長并對于酶蛋白具有一定的保護作用,但是高濃度的鹽含量可能使酶大量失活,破壞其穩定性。酶活的降低造成化學成分變化緩慢,發酵周期延長,不利于工業化生產,另外,過高的鹽含量也與當今世界提倡的食品低鹽化相抵觸,阻礙腐乳醬的推廣。故NaCl含量為4%的酶解效果較理想。2.1.5酒度和糖度的配比腐乳醬后酵期配料的加入對成品的風味、質量有很大的影響,配料主要都是由料酒和NaCl而成。酒料在后酵中既能促成風味物質(如酯類)的形成,又會抑制蛋白質的降解。要兼顧兩方面的作用,使蛋白質有適宜的降解同時保證風味物質的形成,就必須選擇好酒料的酒度。本實驗研究了不同乙醇含量對氨基酸態氮含量的影響,結果見圖5。結果表明,在體系乙醇含量<3%時,氨基酸態氮含量變化不明顯;>3%時,氨基酸態氮含量有所下降,但下降的速度緩慢。說明在低酒度環境下,蛋白酶對乙醇具有一定的耐受度。這對于以乙醇代替食鹽做防腐抑制劑,實現腐乳醬的低鹽化生產具有一定的實際意義。因此,可以在添加4%的食鹽的同時,添加3%的乙醇來防止后期成熟過程中有可能出現的雜菌污染。2.2正交實驗結果實驗結果表明(表3~表5),從氨基酸態氮含量看,各因素對結果的影響順序為:A>B>C。在置信度為95%下,只有固形物含量為顯著性因素。所以根據氨基酸態氮的結果來確定3因素的優化組合是:A2B3C3。以感官評分為指標時,各因素對感官評分的貢獻順序也為:A>B>C。方差分析結果(表5)顯示,固形物含量對感官評分有顯著的影響。所以根據感官評分的結果來確定3因素的優化組合是:A3B3C3。分別對以氨基酸態氮含量和感官評分為指標的正交實驗結果分析發現,各因素對于2個指標的影響效果是不同的,因此有必要重做以上2組最佳組合,對結果重新進行氨基酸態氮含量分析和感官評價,結果如表6。2組的各項指標與正交實驗結果基本吻合,都在可接受的變化范圍內,2組搭配的氨基酸態氮含量和感官評分均沒有顯著差別,但是A2B3C3組合的略高。因此,在酶促成熟過程中,選取的最佳組合是A2B3C3,即固形物含量13%、酶解溫度50℃、蛋白酶用量2.5%。2.3成熟時間對量的影響根據單因素和正交實驗所確定的最佳酶促降解條件,測定氨基酸態氮含量隨成熟時間的變化曲線,結果如圖6示。結果表明,后期成熟時間5d時,氨基酸態氮含量基本上沒有變化,蛋白酶催化作用已達到飽和,酶解階段基本完成,此時氨基酸態氮含量達到0.59%,已基本成熟。2.4熱處理終止發酵的效果本實驗采用加熱的方法使蛋白酶失活從而達到終止發酵的目的。結果如表7所示。結果表明,熱處理終止腐乳醬發酵的效果比較理想。加熱溫度低時無抑制作用,而加熱溫度在80℃以上時,可起到一定的抑制作用,在90℃以上時終止發酵的效果最理想。因此,可以采用熱處理方法抑制腐乳醬成品的繼續發酵,溫度可以選擇為90~100℃。2.5質量分析2.5.1物理分析理化指標測定結果見表8。結果表明,腐乳醬成品的水分、總酸和氨基酸態氮指標都與傳統白腐乳比較接近,但是食鹽含量大大降低。2.5.2產品的質構特性鑒于腐乳醬的形態特征,擬只對物性指標中的稠度和黏性指數進行分析。稠度是涂抹性質的量化反映,稠度越小,說明越容易涂抹;黏性指數反映了成品的黏著性,黏性指數越大,咀嚼時口腔的舒適感越差。圖7為腐乳醬的質地特征曲線,產品的質構分析結果見表9。質構分析結果表明,腐乳醬的稠度與黏性指數均與丘比沙拉醬相近,說明經過調質后在質地上達到了涂抹型調味品的要求。2.5.3總酸和總酸含量本研究借助統計分析軟件SPSS13.0對腐乳醬的成分組成與物性進行相關分析,旨在探討內在質量指標之間的相關關系,為其品質改進提供新的思路。分析結果見表10。首先對與基本風味密切相關的理化指標總酸、氨基酸態氮和鹽含量的相關性分析。(1)腐乳醬中氨基酸態氮與總酸含量的Pearson相關系數為0.438,為正相關,說明蛋白質降解的產物中酸性游離氨基酸對總酸的含量有較大貢獻。(2)當鹽的質量分數>8%時,對蛋白酶的活性有顯著抑制作用。腐乳醬中氨基酸態氮與鹽含量的Pearson相關系數為-0.225,為負相關,說明生產中增加鹽的含量會抑制蛋白酶的活性,使成品的氨基酸態氮含量降低。(3)總酸與鹽含量的Pearson相關系數為0.351,呈正相關,這與游離氨基酸在總酸中有較大貢獻有關,說明在低濃度下,NaCl的存在有利于酶促過程的進行,有利于蛋白酶的浸提,生成更多的游離氨基酸。由表10可以看出,水分、氨基酸態氮和粗脂肪含量與產品的物性間有一定相關性,而且Pearson相關系數較高,水分含量與稠度和黏性指數的Pearson相關系數分別為0.697和-0.749,在置信度95%下,都為顯著性因素。氨基酸態氮含量與稠度和黏性指數的Pearson相關系數分別為0.696和-0.606,其中在95%置信度下,對于稠度為顯著性因素。而粗脂肪與稠度的Pearson相關系數為0.773,在95%置信度下也為顯著性因素。因此可以認為,化學組成對物性有一定的影響。尤其是水分含量、氨基酸態氮含量和粗脂肪含量,但化學組成并不是決定其物性的唯一因素,其他因素也影響成品最終的物性。2.5.4風味物質測定結果表明(圖8、圖9),與市售腐乳相比,腐乳醬的風味物質更為豐富。酯類和醇類等主要風味物質均比市售腐乳要高。尤其酯類物質是構成風味的主要物質,如丙酸正丁酯、丙位辛內酯、戊酸乙酯及正己酸乙酯等,這些物質主要表現一些水果和花香的風味,這些物質達到良好平衡時就可以賦予物質柔和、芳香的風味。同時成品中存在一些產生特殊風味的物質,如1-辛烯-3-醇、2-壬酮,這2種風味物質也是Camembert干酪的主要