葛根素對早期糖尿病腎病大鼠腎組織bmp-7及mrna表達的影響

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥。漸進性腎損害是糖尿病和糖尿病患者最終死亡的主要原因。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bonemorphogeneticprotein-7,BMP-7)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforminggrowthfactor-β,TGF-β)超家族成員之一,不僅在腎臟發(fā)育形成、維持正常功能中具有重要作用,還能夠明顯改善腎纖維化進程。在1型糖尿病大鼠DN形成早期和進展中,大鼠腎臟BMP-7及其受體表達減少或喪失。近年來研究發(fā)現(xiàn),體外BMP-7能通過抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(Tubularepithelialtomenchymaltransdifferentiation,EMT)過程,抑制腎小管上皮細胞Ⅰ型膠原、α-平滑肌肌動蛋白、E-鈣黏素、纖維連接蛋白和結(jié)締組織生長因子(Connectivetissuegrowthfactor,CTGF)的表達,并逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT,使腎小管的動態(tài)平衡恢復(fù)和腎功能改善,從而可以防治DN腎小球和腎間質(zhì)纖維化,亦可能通過人白細胞介素6、單核細胞趨化蛋白1等介質(zhì)的表達來發(fā)揮作用。近年來實驗研究證實,葛根素(Puerarin,Pue)可顯著改善糖尿病小鼠胰島素抵抗,降低糖尿病大鼠血糖,對DN大鼠腎病變有保護作用。本研究在Pue降血糖的基礎(chǔ)上,進一步研究其對鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的早期DN模型大鼠生化指標、腎組織病理形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)的改變與BMP-7蛋白、mRNA表達的影響,探討其對DN腎組織損害的保護作用及可能機制。1材料表面1.1光學(xué)顯微鏡和pcr擴增檢測7600型全自動生化分析儀(日本日立公司);LKB-NOVA型超薄切片機(瑞典LKB公司);BX51F32H01型光學(xué)顯微鏡(日本Oympus公司);JEM-1230型電子透射式顯微鏡(日本電子公司);PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司);DYY-8C型中壓電泳儀(北京市六一儀器廠);DK-8D型電熱恒溫水槽(上海躍進醫(yī)療器械廠);TanonGIS-2016凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。1.2試劑與試劑盒Pue(揚子江藥業(yè)集團有限公司,批號:20081106,純度:100.5%);依那普利(濟南利民制藥有限公司,批號:1001121,規(guī)格:10mg);STZ(美國Sigma公司,批號:S-0130);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,湖南爾康制藥有限公司,批號:20090701);枸櫞酸、枸櫞酸鈉(臺山市新寧制藥有限公司,批號分別為20080601、20091203);葡萄糖、尿素氮測定試劑盒(日本和光純藥工業(yè)株式會社,批號分別為EH578、EG963);肌酐、尿蛋白液體試劑盒[德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司,批號分別為60971014/1、60065769];尿微量白蛋白液體試劑盒(濰坊三維生物工程集團有限公司,批號:110201);胰島素放射免疫分析藥盒(天津市協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司,批號:201011);兔抗大鼠BMP-7多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,批號:bs-2242R);通用型SP免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號:HK3400805);Trizol(美國Invitrogen公司,批號:51512101);逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(美國MBIFermentas公司,批號:00066575);引物合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。1.3動物健康SD大鼠,♂,體質(zhì)量200~250g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物使用合格證號:SCXK(皖)2005-001]。2方法2.1空腹血糖檢測大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,參照文獻,禁食不禁水12h,一次性ipSTZ(溶于0.1mol/L枸櫞酸緩沖液中)50mg/kg,72h后尾端采血,測定空腹血糖(Fastingbloodglucose,FBG),選擇血糖值為13.8~30mmol/L者進行實驗。挑選合格大鼠70只,均分為5組,即模型(0.5%CMC-Na)、依那普利(1mg/kg)與Pue高、中、低劑量(200、100、50mg/kg)組。另設(shè)正常對照(0.5%CMC-Na)組。ig給藥,每天1次,連續(xù)5周。2.2腎組織中戊二醛檢測給藥前2天,將大鼠置于代謝籠中,收集24h尿液,3000r/min離心15min,取上清。末次給藥后,大鼠禁食不禁水12h,水合氯醛麻醉,打開腹腔,腹主動脈取血,3000r/min離心30min,取上清。切取左側(cè)腎臟,去除包膜,稱質(zhì)量。每組取3~4只大鼠,切取腎皮質(zhì),2.5%戊二醛預(yù)固定待作電鏡觀察,余腎經(jīng)10%中性甲醛固定待作病理形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化檢測。切取右腎稱質(zhì)量后立即于-80℃冷藏以備RT-PCR檢測。2.3單因素應(yīng)用全自動生化分析儀測定血清FBG、尿素氮(Bloodureanitrogen,BUN)、血肌酐(Serumcreatinine,Scr)、尿液尿蛋白(Urinaryprotein,Upro)和尿液微量白蛋白(Urinarymicrocontentalbumin,UmAlb);放射免疫法測定血清胰島素(Insulin,Ins)。2.4in-：是否為hs-maun染色經(jīng)10%中性甲醛固定的腎組織,常規(guī)脫水,石蠟包埋,制成厚3μm切片,行蘇木素伊紅(Haematoxylin-eosinstain,HE)染色,用于顯示腎小球系膜細胞增生與毛細血管開放性。行馬松三色(Masson)染色,用于顯示腎小球系膜區(qū)和腎小管膠原增生情況。行過碘酸雪夫氏(PeriodicacidSchiff,PAS)染色,用于顯示腎小球系膜細胞增生、腎小管腫脹與腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)糖原染色情況。2.5小鼠肝腎超微結(jié)構(gòu)改變?nèi)∧I皮質(zhì),剪成1mm2大小,2.5%戊二醛預(yù)固定,1%餓酸固定,常規(guī)處理,環(huán)氧樹脂包埋,切片、染色、裝片,20000倍電鏡下觀察腎小球毛細血管基底膜、足細胞、腎小管上皮細胞等超微結(jié)構(gòu)改變情況并攝片。2.6u3000檢測大鼠bmp-7-健康使用免疫組化過氧化物酶標記的鏈霉卵白素法(SP法)進行腎皮質(zhì)BMP-7蛋白表達檢測。左腎組織經(jīng)10%中性甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片厚3μm,常規(guī)脫蠟、水化,置于檸檬酸(0.01mol/L,pH6.0)緩沖液中微波加熱進行組織抗原修復(fù),置于雙氧水中室溫孵育5min,滴加正常山羊血清(試劑A)室溫封閉15min;滴加一抗兔抗大鼠BMP-7多克隆抗體[1∶200(V/V)稀釋],室溫孵育60min,PBS液沖洗,滴加二抗為生物素化的羊抗兔IgG(試劑B),37℃孵育15min,PBS液沖洗;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素(試劑C),37℃孵育15min,PBS液沖洗;室溫下滴加DAB顯色劑,顯微鏡下觀察顯色效果,至棕黃色時用蒸餾水中止顯色,蘇木素輕度復(fù)染、脫水,二甲苯透明,樹脂封片。光鏡(400×)視野下,每組隨機選取不重復(fù)的20個腎小球,由兩人觀察陽性細胞的分布與染色情況。參照Fromowitz綜合計分法進行判定:總分=陽性細胞比例分值+染色強度分值。染色強度評定標準:陰性為0分;染色雖弱但明顯強于陰性對照者為1分;染色強度中等者為2分;染色強者為3分。染色陽性細胞比例評定標準:陽性細胞數(shù)<5%為0分;5%~25%者為1分;26%~50%者為2分;51%~75%者為3分;>75%者為4分。兩種評分相加,將結(jié)果分為4個等級:0~1分為(-);2分為(+);3~4分為(++);5~7分為(+++)。按綜合評分的等級來評價切片指標變化情況。2.7rt-pcr擴增從大鼠右側(cè)腎臟取腎皮質(zhì)200mg,采用Trizol試劑嚴格按照說明書的步驟及要求提取總RNA,測得所提取的RNAA260/A280范圍為1.6~2.0,且凝膠電泳顯示18s和28s條帶清晰,說明純度良好。參照RT-PCR試劑盒操作規(guī)程合成25μlcDNA,PCR擴增BMP-7基因片段。PCR擴增反應(yīng)條件:94℃變性4min,94℃30s,61℃60s,72℃60s,35個循環(huán),72℃延伸10min。引物序列為BMP-7323bp:上游5′-AGACGCCAAAGAACCAAGAG-3′,下游5′-GCTGTCGTCGAAGTAGAG-GA-3′;內(nèi)參GAPDH195bp:上游5′-CCATGGAGAAGGCT-GGGG-3′,下游5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。反應(yīng)后取10μlPCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳,Bandscan圖像分析系統(tǒng)分析各條帶吸光度,每組標本重復(fù)檢測5次。BMP-7的相對表達量以BMP-7與GAPDH的光密度比值表示。2.8lsd和sak顯著性檢驗法應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件,組間比較采用單因素方差分析(OneWayAnova),選擇LSD和SAK顯著性檢驗法,所有數(shù)據(jù)用x±s表示,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化半定量分析采用Wilcoxon秩和檢驗法。3結(jié)果3.1各組大鼠血糖、體質(zhì)量和尿量與正常對照組比較,模型組大鼠FBG、24h尿量和KW/BW均顯著升高(P<0.01),體質(zhì)量和Ins顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,Pue高、中、低劑量組大鼠FBG和KW/BW顯著降低(P<0.01或P<0.05),大鼠體質(zhì)量和Ins顯著升高(P<0.01或P<0.05);Pue高、中劑量組24h尿量顯著降低(P<0.01或P<0.05)。Pue對模型大鼠FBG、Ins、24h尿量、體質(zhì)量、KW/BW的影響見表1。3.2pue對大鼠bun、scr、umalb的影響與正常對照組比較,模型組大鼠BUN、Scr、24hUpro、24hUmAlb顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,Pue高、中、低劑量組大鼠BUN、Scr顯著降低(P<0.01或P<0.05);Pue高、中劑量組24hUpro、24hUmAlb顯著降低(P<0.05)。Pue對模型大鼠血清BUN、Scr、24hUpro、24hUmAlb水平的影響見表2。3.3pue對模型中大鼠腎組織病理學(xué)形態(tài)的影響3.3.1小鼠小鼠基底膜增注效果正常對照組腎小球無明顯病理改變,結(jié)構(gòu)完整,毛細血管開放;模型組可見腎小球肥大,腎小球基底膜明顯增厚,系膜區(qū)增寬,系膜細胞高度增生,呈彌散性分布、團塊狀聚集擠壓毛細血管,毛細血管腔狹窄或閉塞;各用藥組腎小球基底膜增厚程度顯著改善,毛細血管腔狹窄程度明顯減弱。Pue對模型大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)的影響見圖1(HE染色)。3.3.2腎間質(zhì)及炎癥細胞浸養(yǎng)正常對照組腎組織染色部位主要位于基底膜、系膜區(qū)和腎小管間的毛細血管周圍,腎間質(zhì)無炎癥細胞浸潤及纖維化;模型組腎小管萎縮、管腔閉塞,腎間質(zhì)有大量炎癥細胞浸潤,明顯纖維化,亮綠色纖維組織增生;與模型組比較,各用藥組腎間質(zhì)纖維化程度均減輕。Pue對模型大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)的影響見圖2(Masson染色)。3.3.3各組系膜細胞病變情況比較正常對照組腎小球結(jié)構(gòu)完整,系膜區(qū)未見異常;模型組腎小球體積增大,呈分葉狀,系膜區(qū)增寬,系膜細胞增生,間質(zhì)浸潤細胞逐漸增加,腎小管上皮細胞腫脹,呈玻璃樣變,毛細血管腔狹窄或閉塞;與模型組比較,各用藥組系膜細胞增生與毛細血管閉塞程度均有所減輕。Pue對模型大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)的影響見圖3(PAS染色)。3.4小鼠足細胞融合模型正常對照組腎小球毛細血管袢結(jié)構(gòu)清晰,基底膜厚度均勻一致,足細胞較完整,足突排列較整齊,與基底膜垂直;模型組腎小球毛細血管基底膜不規(guī)則增厚、系膜區(qū)擴張伴電子致密物形成,足細胞不完整,足突排列紊亂,部分形成融合;各用藥組腎小球毛細血管基底膜增厚明顯改善,足細胞較完整,足突排列較整齊,融合現(xiàn)象明顯減輕。Pue對模型大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響見圖4。3.5影響bmp-7蛋白和mrna在大鼠腎組織中的發(fā)現(xiàn)3.5.1各組大鼠輸注后bmp-7蛋白表達比較模型組腎小球系膜細胞無或弱陽性表達;正常對照組腎小球著色部位廣泛,以腎小球系膜細胞為主,呈強陽性表達,在部分腎小管上皮細胞及間質(zhì)也有表達,且表達顯著高于模型組(P<0.01);各用藥組陽性染色部位與正常對照組相似,與模型組比較BMP-7蛋白表達均顯著增強(P<0.01或P<0.05)。Pue對模型大鼠腎組織BMP-7表達的影響見圖5、表3。3.5.2各組大鼠腎組織表達的bmp-7mrna表達比較BMP-7mRNA在正常對照組表達最強;與正常對照組比較,模型組腎組織BMP-7mRNA表達顯著降低(P<0.01);與模型組比較,Pue高、中、低劑量組和依那普利組能顯著增加大鼠腎組織表達的BMP-7mRNA水平(P<0.01或P<0.05)。大鼠腎組織BMP-7mRNA凝膠電泳圖見圖6。4dn大鼠腎功能損害本實驗通過STZ對大鼠胰島B細胞的選擇性破壞誘導(dǎo)DN模型,造模時每組動物數(shù)為14只,在實驗過程中,由于血糖高以及感染等原因造成部分動物死亡,導(dǎo)致每組最后動物存活數(shù)均不一致。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),糖尿病成模后30d,模型動物已呈現(xiàn)出早期DN癥狀。本次實驗按劑量50mg/kgip一次性給藥,72h后大鼠血糖顯著升高,98%大鼠血糖在13.8mmol/L以上,實驗過程中模型組大鼠表現(xiàn)出精神萎靡、體質(zhì)量明顯減輕、反應(yīng)遲鈍、尾部壞死及典型的“三多”癥狀。因此,大劑量STZ復(fù)制DN模型是成功的。DN模型大鼠5周時,KW/BW增加,生化指標檢測BUN、Scr、24hUpro及24hUmAlb均較正常對照組升高,Ins明顯降低,提示DN大鼠腎臟細胞處于增殖和肥大狀態(tài),腎功能已嚴重減退。Pue各劑量組可逆轉(zhuǎn)以上各項生化指標,對DN大鼠腎功能損傷有干預(yù)作用。DN是由糖尿病所致的腎小球微血管病變而引起的蛋白排泄和濾過異常,Upro和UmAlb排泄率可靈敏地反映腎臟損害的程度,被用來作為DN診斷和預(yù)后判斷的重要指標。依那普利為臨床常用的第2代血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensinconvertingenzymeinhibitors,ACEI)類制劑,對糖尿病腎損害具有明確的保護作用。實驗證明依那普利可降低Upro和UmAlb排泄率,減輕腎間質(zhì)纖維化,同時還可以顯著上調(diào)DN大