燈盞花素與ly333531對糖尿病大鼠腎臟的保護作用

通過臨床和實驗研究，發現應用添加劑和蛋白激酶c（pdc）抑制劑可以緩解糖尿病腎病（dn）的進展。燈盞花素(breviscapine)是從菊科飛蓬屬植物短亭飛蓬全草燈盞細辛中提取出的一類黃酮類成分,其藥理作用有較強抗氧化、抑制PKC活性作用,已初步發現其能降低蛋白尿、改善腎小球結構異常。本研究以PKC抑制劑LY333531為對照探討燈盞花素對大鼠糖尿病模型腎臟保護作用機制,旨在為燈盞花素應用于DN的干預提供實驗依據。材料和方法一、糖尿病模型建立方法40只昆明種雄性SD大鼠(體重180～200g,本大學動物中心提供)在接受右側腎切除術2周后隨機分為對照組(C)、模型組(M)、燈盞花素組(M+B)與LY333531組(M+L),每組10只。糖尿病模型建立采用腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司)60mg/kg方法。用藥方案:LY333531(美國禮來公司)10mg·kg-1·d-1,灌胃給藥;燈盞花素(含黃酮4.5mg/20mg,云南玉溪藥業有限公司)20mg·kg-1·d-1,灌胃給藥;對照組、模型組給予等量溶媒。所有大鼠在整個實驗期間均喂標準飲食,自由飲水,不應用胰島素,整個實驗觀察8周。二、腎組織pas染色大鼠處死前2d進代謝籠,收集24h尿,保存在-70℃冰箱中待測尿白蛋白及丙二醛(MDA)含量。右側頸總動脈插管收集血標本測血糖水平。腎臟通過4℃預冷的生理鹽水反復灌洗,顏色蒼白后游離,取8mm3大小腎組織置于10%中性甲醛溶液中固定,石蠟包埋,3μm切片行PAS染色,4μm多聚賴氨酸處理切片行免疫組化。剩余腎組織切成小塊,置于液氮中,凍透后轉入-70℃冰箱中待測腎組織MDA含量及超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-PX)與PKC活性。三、腎組織細胞am活性測定采用EIA法,嚴格按照試劑盒(法國SPI公司)說明書操作。高倍鏡下隨機選擇30個腎小球,采用真彩色病理圖像分析系統軟件(北京航空航天大學)測定腎小球平均面積(AG)、腎小球平均容量(VG)及腎小球系膜區面積(AM)。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法,SOD活性采用聯苯三酚自氧化法,CAT活性采用紫外速率測定法,GSH-PX活性采用NADPH耦聯法,嚴格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書操作。腎組織細胞膜和細胞漿分離采用超速離心法。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。PKC活性采用放射活性測定法,嚴格按照試劑盒(美國Calbiochem公司)說明書操作,酶的活性單位為pmol·mg-1·min-1。胞漿PKC(PKCc)及胞膜PKC(PKCm)活性均以所測的實際活性與對照組所得的活性之差表示,細胞PKC總活性(PKCt)為胞漿及胞膜PKC活性之和。5.免疫總抗體tgf-1、ss法石蠟切片常規脫蠟,用3%H2o2甲醇封閉內源性過氧化酶,TGF-β1予微波爐暴露抗原,結締組織生長因子(CTGF)予胰蛋白酶消化暴露抗原。1:10正常羊血清或兔血清及10%小牛血清白蛋白充分封閉非特異性抗原。加兔抗大鼠TGF-β1多單克隆抗體(1:100)或小鼠抗大鼠CTGF單克隆抗體(美國SantaCruza,1:50),4℃過夜。再加生物素化相應二抗(武漢博士德公司,1:200)室溫30min,滴加鏈酶親和素-生物素復合物(SABC,武漢博士德公司)室溫30min,滴加DAB(北京中山公司)顯色液,鏡下控制著色時間。蘇木素復染,常規脫水、透明、封片。實驗采用刪除第一抗體作陰性對照。陽性物質呈棕色顆粒狀,同樣應用上述圖像分析軟件計算陽性指數(PI):[陽性信號面積×平均陽性強度(平均灰度值)]/腎小球面積,取平均值。四、統計處理數據以表示,應用SPSS10.0軟件包進行統計分析,采用One-WayANOVA檢驗。結果一、血糖、體重變化與對照組比,模型組血糖明顯升高(P<0.01)、體重明顯降低(P<0.01);兩給藥組血糖與模型組無明顯差異,LY333531組體重明顯高于模型組(P<0.05)。模型組腎重、腎重/體重及AER明顯高于對照組(P<0.05,P<0.01),兩給藥組這些指標明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。二、vg與am檢測PAS染色光鏡下,圖象分析顯示模型組AG、VG與AM明顯高于對照組(P<0.05,P<0.01);兩給藥組AG、VG與AM明顯低于模型組(P<0.05),見表2,圖1。三、腎組織及尿mda,sod、cat及gsh-px活性模型組腎組織及尿MDA含量明顯高于對照組(P<0.01),腎組織SOD、CAT及GSH-PX活性明顯低于對照組(P<0.05,P<0.01);兩給藥組腎組織及尿MDA含量明顯低于模型組(P<0.05),SOD、CAT及GSH-PX活性明顯高于模型組(P<0.05)。另外,燈盞花素組腎組織及尿MDA含量明顯低于LY333531組(P<0.05),GSH-PX活性明顯高于LY333531組(P<0.05)。見表3。四、kcm活性及pkcm/pkcc顯著的比較模型組腎組織PKCt活性、PKCc活性、PKCm活性及PKCm/PKCc明顯高于對照組(P<0.05,P<0.01);兩給藥組上述指標明顯低于模型組(P<0.05),見表4。五、對肝腎-間質的影響TGF-β1與CTGF在對照組腎小球有少量表達;在模型組表達明顯增加,除表達于腎小球外,腎小管-間質也有少量表達;在兩給藥組表達明顯減少。免疫組化半定量分析顯示,模型組TGF-β1、CTGF與PI值明顯高于對照組(P<0.01);兩給藥組PI值明顯低于模型組(P<0.05)。見表5,圖2,圖3。燈盞花素及其產物研究揭示DN的發病在代謝紊亂與血流動力學機制基礎上,主要以氧化應激增加產生的氧反應產物(reactiveoxygenspecies,ROS)、PKC激活為上游信號分子所誘導的各種細胞介質、生長因子等綜合作用結果。但單純抗氧化、抑制PKC活性僅能部分減輕白蛋白尿、改善腎小球結構異常。近期,研究發現ROS與PKC激活既能各自通過細胞內信號轉導誘導損傷介質致腎臟損害,又能相互激發、活化使腎臟損害加重。PKCN末端調節亞單位含鋅結合、富半胱氨酸基序,可為過氧化物氧化激活,過氧化氫可通過酪氨酸激酶直接激活PKC。糖尿病環境中,高糖、糖基化蛋白、多元醇通路及游離脂肪酸除自身氧化產生ROS外,可通過NADPH氧化酶途徑產生ROS,腎內該酶為PKC依賴性激活。選擇一種既有抗氧化作用,又能抑制PKC活性的藥物可能具有更強的腎臟保護作用。燈盞花素分子中含有還原性酚羥基,既可非競爭性抑制PKC活性,又可直接清除羥氧自由基、過氧自由基和淬滅單線態氧,抑制脂質過氧化,還可通過提高抗氧化酶系統活性等產生間接的抗自由基作用。蔣濤等證實燈盞花素可抑制高糖所誘導的c-fos、c-jun蛋白表達與Ⅳ型膠原合成增加。李英等報道燈盞花素可降低STZ誘導的糖尿病模型蛋白尿、改善腎小球結構異常,并可明顯抑制腎內PKC轉移激活。初步的研究表明燈盞花素對DN有一定的治療作用,其對糖尿病模型腎內氧化應激的影響尚未見文獻報道。我們的研究表明燈盞花素給藥8周可明顯減輕糖尿病大鼠AER的增加與腎臟肥大,與文獻報道一致。糖尿病模型組腎組織和尿中MDA明顯增加,抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX等活性明顯降低,燈盞花素組腎組織與尿MDA含量明顯降低,抗氧化酶得到部分恢復,其中GSH-PX活性接近對照組水平。盡管另一種PKC抑制劑LY333531也有部分抗氧化應激作用,但本研究結果顯示燈盞花素對糖尿病腎組織氧化應激增加具有更強的抑制作用。本組同樣證實燈盞花素與LY333531一樣可明顯抑制糖尿病腎組織PKC活性的增加。近年研究表明ROS與PKC激活可通過p38有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活劑(JAK/STAT)途徑誘導核轉錄因子κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)基因轉錄,上調TGFβ1表達,通過其下游反應介質CTGF介導使細胞外基質(ECM)合成增加,腎小球硬化加速,促進DN發展。據報道LY333531可抑制高糖培養的腎小球系膜細胞與糖尿病模型腎內TGF-β1表達,燈盞花素對糖尿病腎內TGF-β1與CTGF表達的影響尚未見文獻報道。本研究免疫組化結果表明,兩給藥組腎小球TGF-β1與CTGF表達程度較模型組明顯減輕。由于TGF-β1除致ECM積聚外,同時具有抗炎癥、抗增殖等作用,如長期阻斷TGF-β