纖維素酶處理對(duì)黃芪多糖提取效果的影響

近年來(lái)，酶法用于提取草藥的有效成分。通過(guò)選擇合適的酶法，可以提高棗、蛋白質(zhì)、黃酮和多糖等活性成分的產(chǎn)量。關(guān)于酶法提取多糖已經(jīng)有些報(bào)道,常用的酶制劑包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和淀粉酶。黃芪的藥用部位為根,多糖是其主要的功效成分之一。黃芪多糖幾乎均以α-糖苷鍵相連,且有的多糖屬于果膠類(lèi)多糖。中草藥的細(xì)胞壁大多主要由纖維素構(gòu)成。黃芪原料及藥渣中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,分別為26%和48%左右。因此,結(jié)構(gòu)多糖中的纖維素可能是制約黃芪多糖最大限度溶出的主要物質(zhì)。纖維素是由D-葡萄糖β-1,4糖苷鍵連接而成,纖維素酶則能特異性地降解纖維素生成葡萄糖等低相對(duì)分子質(zhì)量的糖。因此,本研究探討纖維素酶法提取黃芪多糖,旨在提高黃芪多糖的得率和最大限度地利用黃芪資源。1材料和方法1.1儀器、設(shè)備和儀器回流提取裝置(規(guī)格為1L和10L),實(shí)驗(yàn)室組裝;TU—1800SPC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(chǎng)),AB204—B型電子分析天平(瑞士梅特勒公司),LGJ—18型冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)),—Ⅱ低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)),SCD005SputterCoater離子濺射金,FEIQUANTA200掃描電鏡(PHILIP)。1.2聚合物的制備黃芪為山西產(chǎn)蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao(炮臺(tái)芪),由北京同仁堂飲片廠(chǎng)提供。提取用水均為蒸餾水,分析用水均為雙蒸水。葡萄糖對(duì)照品(Sigma公司),重蒸酚、乙醇、硫酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純,纖維素酶(初始活力單位1800U/g,唐山太博爾生物工程有限公司)。1.3濃硫酸總用量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖。精密取2mL樣品溶液,分別加入5%苯酚溶液1.0mL,搖勻,迅速加入5.0mL濃硫酸,振搖5min,置沸水浴上加熱15min,然后置冷水浴中冷卻30min,隨行空白對(duì)照,在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算多糖量。2結(jié)果分析2.1總糖與還原糖質(zhì)量濃度的測(cè)定稱(chēng)取一定量的黃芪粗粉,加入10倍量水,提取2h后濾過(guò),濾渣均分。每份折合黃芪生藥10g,置于消化管中,升溫至所需溫度,加酶保溫。迅速升溫至沸騰繼續(xù)提取1h,3000×g離心15min,測(cè)定提取液中總糖和還原糖的變化。分別進(jìn)行纖維素酶加入量、酶處理時(shí)間和溫度對(duì)黃芪多糖提取的影響試驗(yàn),試驗(yàn)重復(fù)3次,各指標(biāo)取平均值。文獻(xiàn)報(bào)道將總糖與還原糖質(zhì)量濃度之差作為多糖質(zhì)量濃度。考慮到黃芪中含有較多的蔗糖,由于蔗糖極易溶于水而被提取出來(lái),總糖與還原糖質(zhì)量濃度之差的變化能近似反映出黃芪多糖質(zhì)量濃度的變化。所以,本研究以總糖與還原糖質(zhì)量濃度之差為主要指標(biāo)考察纖維素酶對(duì)黃芪多糖提取的影響。2.1.1時(shí)間單位的確定將濾渣加入8倍量水,纖維素酶加入量分別為0、30、60、90、120、150U/g生藥,處理溫度為50℃,處理時(shí)間為2h。纖維素酶加入量對(duì)黃芪多糖提取的影響見(jiàn)圖1。可以看出,還原糖和總糖的質(zhì)量濃度均隨著加酶量的增加而逐漸增大,其中還原糖的質(zhì)量濃度隨加酶量的增加幾乎呈直線(xiàn)增加,而總糖增加的趨勢(shì)則隨加酶量的增加漸緩。加酶量從30U/g增至60U/g時(shí),總糖與還原糖質(zhì)量濃度之差大幅度增加;從60U/g增至150U/g的過(guò)程,增長(zhǎng)趨勢(shì)比較平緩。2.1.2保溫溫度將濾渣加入8倍量水,根據(jù)加酶量的試驗(yàn)結(jié)果,取加酶量為60U/g生藥,分別保溫0、30、60、90、120、180min,保溫溫度為50℃。纖維素酶處理時(shí)間對(duì)黃芪多糖提取的影響見(jiàn)圖2。可以看出,隨酶處理時(shí)間的增加,還原糖和總糖的質(zhì)量濃度不斷增加。反應(yīng)時(shí)間由0～90min這一階段總糖與還原糖質(zhì)量濃度之差大幅上升,幾乎呈線(xiàn)性增長(zhǎng),從90～180min這一階段的上升趨勢(shì)逐漸平緩。2.1.3不同溫度對(duì)黃芪多糖提取的影響將濾渣加入8倍量水,加酶量為60U/g生藥,根據(jù)酶處理時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果,保溫時(shí)間90min,保溫溫度分別為35、40、45、50、55℃。不同溫度對(duì)黃芪多糖提取的影響見(jiàn)圖3。結(jié)果表明,酶處理溫度從35℃逐漸增至55℃時(shí)還原糖在50℃時(shí)質(zhì)量濃度較高,其他溫度下差別不大;總糖、總糖與還原糖質(zhì)量濃度之差在35～50℃逐漸上升,在45～50℃達(dá)到最大值,之后又慢慢下降。綜合以上纖維素酶處理各因素對(duì)黃芪多糖提取的影響,得到纖維素酶處理的最佳條件為:加酶量60U/g,酶處理時(shí)間90min,處理溫度50℃。2.2工藝方法的提取工藝2.根據(jù)所得到的纖維素酶處理的最佳工藝條件提取黃芪多糖。酶處理工藝為:纖維素酶加入量為60U/g生藥,酶處理時(shí)間90min,溫度50℃。每次試驗(yàn)取生藥800g,第一次提取加10倍量水,提取2,第二次加8倍量水,提取1.5h的工藝作為傳統(tǒng)工藝。加酶工藝按上述酶處理?xiàng)l件在第一次提取完成后,將濾渣加水后進(jìn)行酶處理,然后升溫滅酶后繼續(xù)提取1.5h。同時(shí)進(jìn)行按照加酶工藝保溫但不加酶的對(duì)照試驗(yàn)。將各工藝的兩次提取液分別合并濃縮,加入4倍量無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉,干燥后計(jì)算得率并測(cè)定多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)3次,取均值。不同方法提取黃芪多糖的效果見(jiàn)表1。結(jié)果表明纖維素酶處理工藝的多糖得率比傳統(tǒng)方法有較大幅度提高,多糖得率由24.4%提高至30.3%,增加率為24.2%。比對(duì)照的多糖得率25.2%提高了20.2%。可見(jiàn),在酶處理工藝中的保溫條件對(duì)得率的提高有一定影響,但影響不大。3種方法所得多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56.1%～56.6%,變化不大。2.3掃描電鏡觀(guān)察將黃芪原料,酶處理工藝和傳統(tǒng)工藝所得藥渣的粉末進(jìn)行離子濺射金處理后掃描電鏡觀(guān)察。黃芪原料、藥渣的1000倍下掃描電鏡觀(guān)察見(jiàn)圖4。黃芪原料可見(jiàn)較模糊的纖維狀物質(zhì),上面有較多的粒狀物,可能是淀粉粒、蔗糖等。傳統(tǒng)工藝提取后的藥渣顯現(xiàn)出較模糊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),還有部分其他成分附著在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上。因此,推斷多糖的提取不是很完全。纖維素酶處理后的藥渣其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得非常清晰,附著物很少,提示多糖的提取可能比較完全。3酶處理后多糖的提取黃芪多糖主要采用傳統(tǒng)的水提醇沉工藝提取,得率較低。因此,近年來(lái)仍有許多研究者致力于提高黃芪多糖的得率。采用稀堿溶液提取黃芪多糖,得率提高但堿法提取會(huì)影響黃芪多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)組分變化以及其生物活性有待研究。微波處理應(yīng)用于水提醇沉法提取黃芪多糖,反應(yīng)時(shí)間縮短了12倍,但微波設(shè)備的可操作性和局部受熱不均等使微波提取的應(yīng)用具有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用纖維素酶處理工藝提取黃芪多糖,得到了較好的效果。纖維素酶處理能較大幅度地提高多糖的得率,大多研究報(bào)道集中于對(duì)藻類(lèi)、食用真菌類(lèi)和百合等非木質(zhì)材料的酶處理上,而對(duì)黃芪等木質(zhì)材料的研究報(bào)道較少。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道采用直接酶處理后浸提的方法提取多糖,預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明這種方法對(duì)黃芪多糖的提取并不適宜。根據(jù)傳統(tǒng)工藝黃芪多糖大多進(jìn)行了2次水提的特點(diǎn),本研究采用在第一次提取完成后進(jìn)行酶處理,明顯增加了黃芪多糖的得率。這可能由于黃芪原料組織得到充分軟化,有利于被纖維素酶作用。另一方面,黃芪的一次提取液中含有大量的糖類(lèi)物質(zhì)可能對(duì)纖維素酶的作用形成反饋抑制,將濾液分離后酶處理,有助于提高纖維素酶的效率。另外,黃芪的一次提取液中也含有較多的蔗糖等小分子糖類(lèi),影響纖維素酶的穩(wěn)定性。研究表明,在較高溫度下蔗糖和葡萄糖對(duì)纖維素酶有破壞作用。進(jìn)行第二次水提,既具有鈍化酶的作用,同時(shí)又可將剩余的多糖充分提取出來(lái)。纖維素酶的功能是通過(guò)將細(xì)胞壁主要結(jié)構(gòu)成分纖維素分解為還原糖,它有助于增加多糖的溶出,從而最終提高多糖的得率。總糖和還原糖的分析結(jié)果表明纖維素酶處理能降解黃芪的結(jié)構(gòu)多糖中的纖維素,提高提取過(guò)程中糖的溶出率。不同方法提取黃芪多糖的試驗(yàn)表明,與傳統(tǒng)工藝和對(duì)照相比,酶法所得到的黃芪多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)幾乎不變,但得率大幅度增加。掃描電鏡觀(guān)察結(jié)果進(jìn)一步從微觀(guān)結(jié)構(gòu)上揭示了纖維素酶處理后藥渣的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得十分清晰,黃芪原料的部分結(jié)構(gòu)多糖受到破壞,中間的多糖等物質(zhì)得到了較充分的溶出。總之,本實(shí)驗(yàn)采用的纖維素酶處理工藝簡(jiǎn)單易行,能較大幅度提高黃芪多糖的得率,而且不需進(jìn)行專(zhuān)門(mén)鈍化酶的操作,因此具有很大的工業(yè)化應(yīng)用前景采用Somogyi法測(cè)定直接還原糖。取5mL樣溶液,加入試管(230