基于微衛星dna標記的wzsp遺傳結構研究

豬的生理生化、解剖、新陳代謝、骨骼發育、心血管系統和循環系統類似于人類。由于體型小、操作和飼養管理、飼養成本低、微生物和遺傳控制容易、標準化等特點，實驗動物的應用程序引起了廣泛的關注。在大型養豬業中，建立了f豬群、優質生物制劑、生物材料、動物模型甚至胚胎移植方面發揮著重要作用。實驗用小型豬是生物學研究、尤其是醫學研究領域內——人類醫學動物模型、人類異種器官移植的理想素材,培育近交系豬有著重大的理論研究意義和實用價值。五指山小型豬(WZSP)原產于海南省中南部黎、苗族山寨,是當地少數民族飼養的本地豬種,五指山小型豬具有體型小、性成熟早、抗逆性強等特點,1989年中國農業科學院畜牧研究所對其進行異地保種、近交繁育及開發利用,到目前為止,已近交繁育出第17代,是我國特有的、以多世代近交繁育方式而形成的近交實驗動物。作者利用微衛星DNA標記來檢測五指山小型豬群體雜合度及其多態信息含量,以評價其世代間的群體遺傳結構和遺傳變異的變化,為將該品種早日用于實驗動物研究提供可靠的理論依據。1材料和方法1.1耳組織樣的采集試驗豬:試驗豬群來自中國農業科學院畜牧研究所五指山小型豬(WZSP)保種場,采集的耳組織樣用液氮保存備用。F14(16頭)、F15(20頭)、F16(14頭)3個世代共50個耳組織樣,3個家系中Ⅰ系(16)、Ⅱ系(18頭)、Ⅲ系(16頭)共50頭。其中每個家系都含有3個世代公母各半的五指山小型豬。1.2方法的檢驗和應用所用引物序列從中國農業大學姜盛花碩士畢業論文《微衛星DNA標記對8個中外豬群體遺傳結構的研究》所設計的18對中選取9對做為本試驗的微衛星引物,這9對引物中sw936的85和s0070的264僅在WZSP中出現,s0036、s0070、sw225、sw61、sw205和sw874的雜合度和平均等位基因數均較高,sw2409在WZSP達到了完全純合。1.3基因型的確定和pcr擴增將采集的耳組織用滅菌剪刀剪碎,用常規酚氯仿抽提法提取DNA,用紫外分光光度計檢測其濃度及純度,然后進行PCR擴增,擴增產物在2%的聚丙烯酰胺凝膠穩壓120V電泳12~16h,銀染顯帶,干膠保存。判斷基因型,帶型缺失或模糊的記為0,進行基因頻率的計算。雜合度和多態信息含量通過如下公式進行估計:H=∑i=1rhj/rPIC=1?∑i=1nP2i?∑i=1n?1∑j=i+1n2P2iP2jΗ=∑i=1rhj/rΡΙC=1-∑i=1nΡi2-∑i=1n-1∑j=i+1n2Ρi2Ρj2其中H為群體雜合度,PIC為群體多態信息含量,n為等位基因數,Pi、Pj分別為各個等位基因的頻率。PCR擴增循環程序為:94℃預變性3min;94℃變性45s;退火45s;72℃延伸1min;共擴增34個循環;最后72℃延伸7min,在4℃保存,結束程序。2結果與分析2.1雜合度及基因座特征從表1的結果可以看出,所檢測的微衛星基因座有1~3個等位基因,各基因座等位基因頻率由0.1250~1.0000不等;雜合度處于0.0000~0.6226之間,多態信息含量為0.0000~0.5480;9個平均雜合度為0.3849,平均多態信息含量為0.3270。Bostein等提出了衡量基因變異程度高低的多態信息含量指標,當PIC≥0.5時,該基因座為高度多態基因座;當PIC≤0.25時,為低度多態基因座;當0.25≤PIC≤0.5時,為中度多態基因座。2.2個體系中pic13的表達從表2的結果可以看出,9個微衛星基因座雜合度和多態信息含量在F14、F15、F163個世代分別為0.4163、0.3789、0.3092和0.3446、0.3230、0.2676,呈現遞減,即H14≥H15≥H16和PIC14≥PIC15≥PIC16。由此可見,隨著近交世代的遞增,群體的遺傳變異性逐步降低,反之其群體遺傳純合度越來越高。2.33各家系間的遺傳多樣性比較從表3的結果可以看出,3個家系9個微衛星基因座的平均雜合度(H)和平均多態信息含量(PIC)分別為0.2934、0.2075、0.3005和0.2227、0.1588、0.2408,說明通過選種選育3個家系已成為3個獨立的家系。3討論3.1群體遺傳穩定性微衛星由2或3個核苷酸重復序列所構成的核心部分和兩端的側翼序列組成。側翼序列使微衛星特異地定位于基因組某一位置,核心部分堿基重復數目的不同則是形成微衛星多態性的基礎。微衛星具有多態性高,共顯性標記的特點。其雜合度和多態信息含量(PIC)都是表示群體內遺傳變異大小的測度。PIC、雜合度大說明群體內基因型一致性差,遺傳變異大;反之,PIC、雜合度小則說明群體遺傳變異性小。本試驗選取的微衛星基因座是參照中國農業大學姜盛花碩士畢業論文《微衛星DNA標記對8個中外豬群體遺傳結構的研究》中的18個微衛星引物中選取不同染色體上的9個。由表1可知,五指山小型豬在9個微衛星座位的平均等位基因數僅為2.11,雜合度和多態信息含量分別是0.3849和0.3270,與其他豬種相比明顯較低。VanZeveren等用7個微衛星座位研究4個比利時豬種的平均雜合度在0.54~0.67之間;Dimoski等用18個微衛星座位測得約克夏、大白豬(英系約克下)的平均雜合度分別為0.53和0.60;樊斌等用27個微衛星座位測得湖北省3個主要地方豬種通城豬、清平豬和陽新豬的平均雜合度和平均PIC分別為0.7489、0.6987、0.6273和0.7433、0.6839、0.6094。可見,五指山小型豬群體的基因多態性低,遺傳變異程度最低,特別是在sw2409位點與s0036位點達到了完全純合,說明該群體具有一定的遺傳穩定性,已成為一個穩定的遺傳群體。這種結果與五指山小型豬是高度近親繁殖形成的近交系的事實相符。3.2小型豬fps型遺傳多樣性分析由于微衛星座位的特性,使它在親仔鑒定、胚胎移植、混合受精、親緣關系分析和品種遺傳純度分析上十分重要。由表3可知,9個微衛星基因座雜合度和多態信息含量在五指山小型豬F14、F15、F163個世代均小于0.5且呈現遞減性,即H14≥H15≥H16和PIC14≥PIC15≥PIC16。由此可見,五指山小型豬的近交程度較高,隨著近交代數的上升,群體的遺傳變異性降低。這說明五指山小型豬經近交培育后,由于自然的近交分化,群體中不斷淘汰不利基因,純化有利基因,使群體基因型趨于純合;并且在長期的封閉繁殖中沒有外來血緣加入,從而導致了遺傳基因多樣性的低水平。這為五指山小型豬特有資源在人類比較醫學研究、實驗動物模型構建等領域的開發利用奠定基礎。3.33家系的遺傳穩定性和基從本試驗所檢測的群體中選出3個家系對其進行了微衛星DNA檢測分析,由表3可知WZSP3個家系在9個微衛星基因座的平均雜合度(H)及平均多態信息含量(PIC)均很低但存在一定的差異,說明這3個家系的多態性低且3個家系小型豬間的遺傳背景有一定的差異。家系Ⅱ的平均雜合度(H)及平均多態信息含量(PIC)分別為0.2075和0.1588,其值小于0.25,而且除了在sw2409位點與s007