健脾益氣止血方對脾胃虛大鼠血清e

在之前的實驗中，觀察到脾虛模型中的異戊大鼠生殖系統受到的影響。本實驗重點觀察益氣類中藥和止血類中藥對于脾氣虛模型雌性大鼠生殖系統雌、孕激素及受體的分別調節作用。1材料和方法1.1實驗動物二級Wistar雌性大鼠,體重200~250克,購于中國預防醫學科學院流行病微生物研究所實驗動物中心。1.2番瀉葉水浸劑治療用藥:以健脾益氣止血方(主要含黃芪、三七等),實驗全部用藥在北京中醫藥大學中藥學院制劑教研室制備。造模用藥:番瀉葉水浸劑。將自來水放入燒杯中,置于電爐上煮沸后,迅速將番瀉葉以50mL水10g番瀉葉的比例投入沸水中浸泡,冷卻后過濾出番瀉葉,余液4℃保存備用。1.3血清孕酮p放射免疫分析測定盒試劑:雌二醇(E2)放射免疫試劑盒(天津德普生物技術和醫學產品有限公司提供);血清孕酮(P)放射免疫分析測定盒(北京北方生物技術研究所提供);濃縮型DAB試劑盒(ZLI-9033)。1.4組件和結構1.4.1各組實驗組b組將55只雌性Wistar大鼠按照體重隨機分為5組:A組為陰性對照組(n=11,簡稱正常組);B組為模型對照組(n=11,簡稱模型組);C組為單純益氣對照組(n=11,簡稱益氣組);D組為單純止血對照組(n=11,簡稱止血組);E組為益氣止血中藥治療組(n=11,簡稱中藥組)。實驗全過程中5組大鼠均在北京中醫藥大學中醫藏象研究室動物室(清潔級)中飼養。1.4.2大鼠的一般情況實驗動物置于室溫(20±2)℃動物實驗室中,5~6只1籠,自由進食飲水,適應實驗環境1~3d。第4天開始造模。B、C、D、E組大鼠每天予以番瀉葉水浸劑3mL灌胃并游泳15min,水深約75cm,水溫(21±1)℃,每5只1組;實驗第12天,C組大鼠每天予以益氣類中藥3mL灌胃,D組大鼠每天予以止血類中藥3mL灌胃,E組大鼠每天予以復方(益氣止血)3mL灌胃,正常組大鼠每天予以3mL生水灌胃。予以治療藥的同時B、C、D、E組每天仍然實施相同的造模因素,直至第17天實驗結束,全部處死取材。1.5觀測指標和方法1.5.1血清蛋白的處理10%水合氯醛將大鼠麻醉(400mg/kg)取血后,斷頭處死,迅速剖開腹腔,摘除卵巢,剝凈脂肪及輸卵管,雙側一起稱重。繼之,剝離子宮,從子宮雙角分叉處剪掉,按左、右分開,分別稱重。1.5.2清200l,取20l大鼠麻醉后,右側股動脈取血,離心,1,600r/min,15min,取上清200μL,待測。檢測按照雌二醇(E2)及孕酮(P)放射免疫試劑盒說明書提供方法進行(雙抗法)。1.5.3微波切片和蘇氏原高效液相大鼠用10%水合氯醛麻醉(400mg/kg)后,取全腦及子宮。石臘切片:迅速入10%甲醛(pH7.4PBS配制),在4℃放置24h。常規脫水、包埋、切片(4~5μm)。常規脫蠟至水。0.3%甲醇-過氧化氫室溫10~20min,PBS沖洗。抗原修復,微波爐4檔10min。冰凍切片:入液氮中,20~30s后取出,溫度平衡后放置于恒溫冷凍切片機內切片(4~5μm)。自然干燥后入丙酮(4℃)固定10min。入PBS液中浸泡洗滌。0.3%TritoxX-100,室溫10min。PBS沖洗。0.3%甲醇-過氧化氫室溫5~10min。PBS沖洗。正常羊血清10~30min封閉后,加25μLⅠ抗(稀釋度1∶100)4℃冰箱過夜。PBS沖洗。加Ⅱ抗37℃溫箱15~30min。PBS沖洗。加Ⅲ抗37℃溫箱15~30min,PBS沖洗。DAB顯色1~2min。蘇木素復染,鹽酸酒精分化,流水沖洗。脫水、透明、樹膠封固。圖像分析在北京中醫藥大學組胚教研室進行。1.6一般情況和一般行為的觀察在實驗期間,每天觀察并記錄大鼠飲水、進食量、體重以及大鼠糞便情況、鼠毛色澤和瞇眼等大體行為改變。1.7統計方法實驗結果均以平均值±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,兩兩比較采用t檢驗,組間差異采用Duncan's檢驗。2結果2.1大鼠一般情況比較造模期間,各模型大鼠的飲水、進食量及體重雖有不同程度的減少,但與正常組比無統計意義;鼠毛色澤枯燥、發黃略呈豎立狀;造模前期糞便稀軟發黃不成形,后期略有改善,但較之正常組仍明顯稀軟而不成形;模型大鼠呈瞇眼狀、困倦、懶動。C、D、E組從開始服食治療用藥后,整體情況均有改善,但其中以E組大鼠整體狀態改善最為顯著,與正常組最為接近,但鼠毛色澤仍不如正常組,大便雖已成形但色較之正常組略黃,瞇眼基本消失,大體活動如常;次之C組大鼠,再次之D組大鼠,二組從外觀來看無明顯差別。2.2育種大鼠的卵重和子宮重量結果見表1。2.3血清中二醇和雌激素的含量正在變化結果見表2。2.4雌花大鼠腦癱的er積分、面積和陽性數量的變化結果見表3。2.5雌花大鼠子宮的er積分、面積和陽性數的變化結果見表4。2.6打開雌性大鼠腦癱的pr積分光密度、面積和陽性結果見表5。2.7成年大鼠子宮的pr積分、光密度、面積和陽性數的變化結果見表6。3中藥復方對臟器神經遞質和臟器組織結構的影響由于ER、PR在全身廣泛分布,與E2、P結合后可直接進入細胞核調控基因表達,從而對機體產生復雜影響。因此,脾氣虛證中E2、P與ER、PR的改變值得探討。實驗結果顯示:經造模后,脾氣虛大鼠子宮、卵巢重量明顯下降,與正常組比較有統計意義(P<0.05)。E2分泌減少,與正常組比較(P<0.05),而P則顯現升高趨勢(與正常組比較無統計意義)。受體檢測顯示:脾氣虛大鼠子宮、下丘腦ER陽性細胞顆粒數、面積、積分光密度均大幅度下降,與正常組比較有高度統計意義(P<0.01);下丘腦PR顯著下降,子宮PR變化則不明顯。腦是雌性激素的重要靶器官,ER、PR分布廣泛。腦內ER、PR與神經元的生長發育、激素的分泌、神經遞質的合成及釋放、性行為等有密切關系。ER、PR與配體結合后,通過神經遞質的釋放調節影響GnRH的分泌,低水平E2導致GnRH分泌的減少,從而使整個下丘腦—垂體—性腺軸產生抑制。因此,脾氣虛時,由于E2和ER的水平下降,影響下丘腦神經遞質分泌,從而對下丘腦—垂體—性腺軸產生抑制。子宮ER與相應配體結合后能增進子宮的血液運行,促進其平滑肌細胞增生肥大。脾氣虛時,由于E2、ER的顯著下降,導致了子宮的萎縮。運用中藥干預后發現,單純益氣藥、單純止血藥和健脾益氣止血藥組成的復方均能增加脾氣虛大鼠子宮、卵巢重量至正常水平。三組藥物均恢復了脾氣虛大鼠E2的分泌水平,其中以中藥復方作用最為明顯。單純益氣藥和止血藥的運用降低了P的水平,然而由這兩種藥物組成的復方卻使脾氣虛大鼠P分泌維持正常水平。對于受體的作用,三組藥物均使脾氣虛大鼠子宮、下丘腦ER水平升高,同樣以中藥復方的作用相對較強;單純益氣藥對下丘腦ER的影響較單純止血藥明顯,而單純止血藥在子宮水平對ER作用較單純益氣藥則更為顯著。經中藥干預后,下丘腦PR均進一步下降;單純益氣藥和單純止血藥使子宮PR明顯下降,但組成中藥復方后,子宮PR水平則反而上升。益氣類中藥和止血類中藥分別可以改善脾氣虛模型大鼠生殖系統功能,說明益氣法和止血法在調節雌性生殖系統功能中有重要作用。而上述二法組成的中藥復方則能產生更好的效果。所選擇止血類中藥,其中部分藥物有強壯、滋補功能,但總體以止血功能為主。通過在受體水平的研究表明,益氣類中藥與止血類中藥的作用位點有不同的側重,益氣類中藥側重影響下丘腦,而止血類中藥側重于子宮。健脾益氣止血復方能夠完全恢復脾氣虛模型大鼠子宮、卵巢重量和E2、P的分泌,其他實驗顯示