心力衰竭大鼠壓力感受性反射與腦內活性氧簇升高的關系

動脈壓的感受性反射是心血管活動的主要調節機制。它以負反映的形式保持動脈血壓的穩定，是一種抑制血液循環和反射的機制。慢性充血性心力衰竭(簡稱心衰)時,壓力感受性反射調節心率和腎交感神經活動的功能減弱,導致交感神經活動增強、外周阻力增加,進一步加重心臟負擔。有研究證實,壓力感受性反射功能衰減促進心衰發展,提示心衰的預后不良。因此,探討壓力感受性反射衰減的機制對于阻止心衰的惡化具有重要意義。動物研究提示,腦內腎素-血管緊張素系統激活是介導心衰狀態下壓力感受反射衰減的重要機制。Gao等報道慢性心衰家兔延髓頭端腹外側區血管緊張素II(angiotensinII,AngII)I型受體(AT1)mRNA和蛋白表達增強。慢性心衰大鼠的孤束核、延髓頭端腹外側區、下丘腦室旁核等心血管中樞AT1受體的蛋白表達也上調。血管緊張素轉換酶抑制劑(agiotensinconvertingenzymeinhibitor,ACEI)或AT1受體拮抗劑losartan能恢復受損的壓力感受性反射功能。但是,中樞AngII增加導致壓力感受性反射功能衰減的細胞內機制尚不清楚。活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)作為AngII通路的細胞內信號分子在心血管的病理生理學領域中作用已引起廣泛關注。AngII不僅增加腦內ROS水平,而且提高NADPH氧化酶的活性,還可上調NADPH氧化酶的表達。心衰時血漿AngII和腦脊液中AngII升高,有研究提示腦內ROS升高與心衰動物壓力感受反射功能減弱密切相關,但具體腦區有待進一步研究。下丘腦是壓力感受反射的整合中樞和控制交感神經傳出活動的關鍵腦區,心衰時下丘腦ROS在壓力感受反射中的作用以及下丘腦ROS水平與來源均未見報道。本實驗在心肌梗死誘發心衰的動物模型,研究壓力感受性反射功能減退與下丘腦ROS升高的關系,探討壓力感受性反射功能衰減的細胞機制。材料和方法1化學試劑及試劑雄性SD大鼠,體重(180-220)g,由美國內布拉斯加醫學中心動物實驗室提供。苯腎上腺素、硝普鈉、tempol、apocynin、DETC(diethyldithiocarbamate)等化學試劑購自Sigma。gp91phoxⅠ抗為兔抗,Ⅱ抗為山羊抗兔IgG(SantaCruz),ECL及BCA試劑盒購自Pierce。呼吸機(Harvard),冰凍切片機(Leica)。化學發光測定儀(Sirius),UVP凝膠成像系統(Upland),生物信號采集和處理系統(PowerLab),腦立體定位儀(Stoelting)。2方法2.1呼吸靜化學檢查36只SD大鼠隨機分為心衰組和對照組。心衰由結扎左冠狀動脈前降支造成心肌梗死所引起的。動物經3%異氟醚吸入麻醉,氣管插管并與呼吸機相接,人工通氣。左側第五肋間開胸,剪開心包膜暴露心臟,在左心耳與肺動脈圓錐之間、左冠狀動脈前降支起始處用6-0號手術線縫扎,逐層關胸,負壓抽吸胸腔內積液和氣體。待動物自主呼吸恢復后,拔除氣管插管,單籠飼養7d。假手術組除不結扎冠狀動脈外,其余步驟同心衰組。術后6周,兩組動物做超聲心動圖,測定心臟血流動力學和左心室內徑。術后6-8周,動物進行壓力感受反射功能測定后,取出心臟,去除大血管、心房和右心室游離壁,沿室間隔縱向剪開左心室,攤平,用視頻掃描儀將整個左室面積(包括室間隔)掃描到電腦中,用SigmaScan軟件計算出左室總面積和心梗疤痕區面積,心梗面積=梗死區面積/左室總面積×100%。2.2腎市場中壓力感受反射對血壓的影響冠狀動脈結扎術后6-8周,兩組動物在烏拉坦(800mg/kg)和α-氯醛糖(40mg/kg)麻醉下行氣管插管,機械通氣。將頭端帶有壓力傳感器的動脈導管經左側頸總動脈向心臟方向插入,經主動脈瓣逆行進入左心室,測得心室內壓(信號由PowerLab信號處理系統保存)后,動脈導管退出左心室,停留在頸總動脈內,測定血壓,心率由脈搏波觸發計算。分離左側腎交感神經,置于引導電極上,用Kwik-Sil膠將神經與電極包繞,起到絕緣目的。血壓、腎交感神經放電、放電積分等輸入PowerLab信號處理系統。先靜脈注射硝普鈉將動物的血壓降至50-60mmHg,緊接著靜注苯腎上腺素,將血壓從50-60mmHg升至150mmHg左右,反射性地引起腎交感神經放電逐漸減弱,甚至完全被抑制。將血壓變化和腎交感神經放電的反應作非線性回歸分析,所得到的曲線被稱為壓力感受反射調節腎交感神經活動的功能曲線。非線性回歸分析方程為:RSNA=A/{1+exp[B(MAP-C)]}+D,其中A為腎交感神經放電的變動范圍,反映壓力感受反射的調節范圍;B為曲線的平均斜率,代表壓力感受反射的敏感性;C為血壓變化中點處(BP50)的血壓值,代表壓力感受反射的調定點;D為曲線的低平臺,反映腎交感神經受抑程度。壓力感受反射功能曲線的最大增益(Gainmax)利用另一公式Gainmax=A1×A2×1/4計算,A1為腎交感神經放電的變動范圍,A2為平均斜率。2.3壓力感受反射功能測定動物麻醉后俯臥位固定于大鼠立體定位儀,頂部正中切開,暴露前前囟,根據大鼠腦圖譜進行定位,側腦室坐標分別是:前囟后0.8mm,中線旁開1.4mm,顱骨表面下3.8mm。顱骨鉆孔后插入微量注射器(10μL),微量注射器與微量灌流泵相接。Tempol(1mmol/L)、apocynin(1mmol/L)、DETC(1mmol/L)3種藥物以1μL/min速度持續灌流10min后,測定壓力感受反射功能的變化。每次給藥間隔時間至少30min。實驗結束后,2%滂胺天藍進行注射點定位。2.4凈生成量的測定采用化學發光法測定ROS水平。2組大鼠深度麻醉后,斷頭,迅速取出全腦放在冰盤上,分離出下丘腦組織,放入預冷(4℃)的Krebs/Hepes緩沖液中(pH7.4)。下丘腦組織切成2mm×3mm×2mm的小塊,保存于Krebs/Hepes緩沖液中、冰上放置。測定時需避光,試管內加入預熱(37℃)Krebs/Hepes液4.5mL,然后加入lucigenin和組織塊,lucigenin終濃度為5μmol/L。試管放入化學發光測定儀中,每30s測定1次發光量,持續5min。其中只加lucigenin不加組織塊的試管是空白對照。超氧陰離子的凈生成量=(測試管-空白管)/組織塊的重量,單位為relativelightunit(RLU)·5min-1·mg-1。為了確定超氧陰離子的來源,下丘腦組織分別與NADPH氧化酶抑制劑apocynin(1mmol/L)、一氧化氮合酶抑制劑NG-monomethyl-L-argine(L-NMMA,1mmol/L)、黃嘌呤氧化酶抑制劑oxypurinol(1mmol/L)、線粒體呼吸鏈抑制劑rotenone(0.5mmol/L)預處理30min,然后按上述方法進行測定。2.5westernblotting檢測ca-射線衍射蛋白表達氧化酶亞單位的蛋白水平檢測每只動物在壓力感受反射功能測試結束后,取出全腦、干冰速凍、-80℃冰箱保存。冰凍切片機將腦作冠狀切片,片厚100μm,在包含室旁核平面的下丘腦腦片上,用16號平針頭取下室旁核組織,兩側的組織塊放在一起作為1例樣本。室旁核組織加入含蛋白酶抑制劑的裂解液,冰上勻漿、超聲破碎30s,4℃以12000×g離心20min,收集上清液。采用BCA試劑盒測定上清液中總蛋白濃度,Westernblotting方法測定上清液中NADPH氧化酶亞單位gp91phox蛋白表達。取總蛋白40μg,經10%SDS凝膠電泳分離后,轉移至PVDF膜。分別用兔抗gp91(Ⅰ抗,1∶2000稀釋)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(Ⅱ抗,1∶5000稀釋)與PVDF膜孵育,ECL曝光,用UVP生物圖像處理系統對蛋白條帶進行掃描和密度分析。以GAPDH為內參照,gp91phox與GAPDH的比值代表gp91phox的蛋白表達量。3分組間比較采用stungntt檢驗數據以均數±標準差(ˉx±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用Studentt檢驗,給藥前后采用配對t檢驗。用SigmaStat統計軟件進行數據分析。結果1血壓、左室收縮期及左室擴張期壓力心衰大鼠的體重與對照組無顯著差別,但左室重量大于對照組(P<0.01)。2組大鼠的血壓、無明顯差異,但心衰大鼠的心率加快(P<0.05)。心衰組左室收縮末期及舒張末期的內徑大于對照組,而左室舒張末期壓力顯著高于對照組(P<0.01)。心衰大鼠的心梗面積占左室總面積的(39.8±4.1)%,見表1。2腎兩種功能結構的相對差異壓力感受性反射功能曲線呈“S”型,見圖1。當血壓升高時,反射性地引起腎交感神經活動抑制。心衰組壓力感受性反射功能曲線的范圍、平均斜率和最大增益均低于對照組,而腎交感神經活動最低值高于對照組(P<0.01)。2組大鼠BP50無顯著差異,見表2。3壓力感受反射曲線超氧陰離子捕獲劑tempol和NADPH氧化酶抑制apocynin增強心衰大鼠壓力感受反射功能曲線的范圍、平均斜率和最大增益,但不影響對照組壓力感受反射曲線各指標;超氧化物歧化酶抑制劑DETC則抑制對照組大鼠壓力感受反射功能,對心衰組無明顯影響,見圖2。4無砂混凝土面為0.0的情況心衰組下丘腦組織中超氧陰離子的濃度明顯高于對照組(P<0.01)。Apocynin降低心衰組超氧陰離子的濃度,而oxypurinol、rotenone和L-NAME預處理則不影響心衰組超氧陰離子的濃度,見圖3。5室內側核nadh氧化亞單位的蛋白質表達心衰大鼠室旁核gp91phox蛋白表達明顯增強,比對照組增加了1.3倍,見圖4。壓力感受反射功能的衰減本實驗觀察到心衰大鼠動脈壓力感受反射調節腎交感神經活動的作用明顯減弱,這與其它實驗性心衰動物所觀察的結果一致。和對照組比較,心衰組壓力感受反射調節腎交感神經活動的敏感性和幅度均降低,表現為壓力感受反射功能曲線平均斜率和最大增益的減小,而且壓力感受反射調節腎交感神經活動的范圍也縮小,表現為降壓時腎交感神經活動的增幅減小和升壓時腎交感神經活動受抑程度減弱,壓力反射功能曲線的最低值升高(圖1)。在心衰病人,壓力感受性反射調節心率的功能也降低,出現心交感神經活動加強和心動過速,嚴重的引發室顫和心臟猝死,增加心衰的死亡率。壓力感受性反射功能減退的機制研究表明,心衰時體內腎素-血管緊張素系統激活,血漿和腦脊液中AngII增加,血漿AngII升高能明顯抑制動脈壓力感受性反射。相反,血管緊張素轉換酶抑制劑或AT1受體拮抗劑能恢復受損的壓力感受性反射功能。但介導AngII衰減壓力感受性反射功能的細胞內信號分子并不清楚。本實驗發現心衰大鼠下丘腦超氧陰離子濃度明顯高于對照組(圖3),側腦室給予超氧陰離子捕獲劑tempol能改善受損的壓力感受反射功能,而應用SOD抑制劑DETC則降低對照組壓力感受反射功能(圖2),提示心衰大鼠下丘腦超氧陰離子升高是壓力感受性反射功能的衰減的重要機制。Gao等也報道心衰家兔延髓頭端腹外側區超氧陰離子增加與壓力感受反射功能衰減密切相關。下丘腦和延髓頭端腹外側區均為壓力感受反射的整合中樞,壓力感受器傳入沖動經孤束核上行至下丘腦,下丘腦還接受大腦皮層、皮層下結構的下行沖動,在此整合后,發出下行神經纖維投射到延髓頭端腹外側區和脊髓中間外側柱,調節交感神經活動。因此,下丘腦超氧陰離子升高導致神經細胞的氧化應激,可能影響壓力感受反射的中樞整合過程,繼而影響到延髓頭端腹外側區和脊髓中間外側柱的交感傳出活動,這些腦區超氧陰離子濃度升高更好地說明壓力感受反射功能減退的中樞機制。超氧陰離子是重要的活性氧成分,由多種致氧化酶催化底物生成的,如NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、線粒體呼吸鏈以及一氧化氮合酶等。在外周組織AngII引起超氧陰離子增加主要源于NADPH氧化酶,在中樞神經系統對超氧陰離子的來源研究較少。本實驗分別應用上述氧化酶抑制劑預處理心衰大鼠的下丘腦組織,僅NADPH氧化酶抑制劑apocynin能抑制超氧陰離子的生成,其它氧化酶抑制劑對超氧陰離子的生成無明顯影響,這一結果表明,心衰時腦內超氧陰離子增加主要來自NADPH氧化酶。NADPH氧化酶由細胞膜亞單位(gp91phox、P22phox)、胞漿亞單位(P67phox、P47phox、P40phox)和Rac1共同組成。當細胞膜亞單位與胞漿亞單位分離時,NADPH氧化酶沒