辛硫磷對小鼠遺傳毒性的研究

有機磷農藥是目前使用最大的農藥。在控制病蟲害的同時，它不可避免地會在農產品上留下殘留。據報道,我國農產品中的農藥殘留污染嚴重,超標率遠高于日本、美國等發達國家。辛硫磷(phoxim)化學名稱為O,O-二乙基-O-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯,是一種高效、低毒、擊倒力強、殘留期短的廣譜有機磷殺蟲劑。隨著甲胺磷等高毒有機磷農藥逐漸被禁止使用,辛硫磷在農業生產中的使用量呈上升趨勢,2005年就達到百萬噸以上。據報道,辛硫磷對雄性哺乳動物具有生殖毒性,可造成大鼠精子數量減少、活動度降低,畸形率升高。而關于其對哺乳類動物遺傳毒性的報道較為少見。因此,本研究首次采用單細胞凝膠電泳試驗與小鼠骨髓細胞微核試驗相結合的方法,評價辛硫磷對小鼠的遺傳毒性,為揭示有機磷農藥的毒性作用機制提供理論基礎。1材料和方法1.1rad650型酶標儀DYCP-31E型水平電泳儀(北京六一儀器廠),E200型熒光顯微鏡(日本尼康公司),BioRad680型酶標儀(美國伯樂公司)。辛硫磷(40%乳油,山東東泰農化有限公司),瓊脂糖、肝素鈉、臺盼藍(0.04%)、溴化乙啶(EB,1μg/ml)均購自美國Sigma公司,Tris(臺灣生工有限公司)。1.2動物分組及分組選擇健康SPF級昆明小鼠60只,體重在20~24g之間,雌雄各半,購自新鄉醫學院動物實驗中心,動物合格證號為2010-007。實驗室溫度為(25±2)℃,相對濕度為50%~55%,明暗比為12h∶12h。試驗期間,動物可自由攝食、飲水。適應性飼養7d后,以辛硫磷對小鼠半數致死劑量(LD50)為依據,在預試驗的基礎上,將小鼠隨機分為6組,分別為陰性對照(生理鹽水)組和10、20、40、80mg/kg辛硫磷染毒組以及陽性對照組,每組10只,雌雄各半。采用灌胃方式進行染毒,染毒容量為10ml/kg,每日1次,連續染毒14d;而陽性對照組采用腹腔注射方式給予環磷酰胺(40mg/kg),每日1次,連續2d。染毒過程中,定期測量并記錄小鼠體重。1.3微核試驗方法染毒結束后,將小鼠脫頸椎處死,取下小鼠兩側股骨,參照史志誠等的方法進行微核試驗。每只小鼠觀察1500個細胞,計數含微核的細胞數,并計算微核率(微核率=微核細胞數/細胞總數×1000‰)。1.4細胞活力及細胞拖尾率取外周血約0.2ml,加入等量Hanks液充分混勻,將外周血混合液用滴管沿管壁緩慢加入預先加有0.2ml淋巴細胞分離液的1ml離心管中,離心后,用毛細管插到云霧層,吸取淋巴細胞,用適量PBS將淋巴細胞濃度調整到104~105/ml。采用MTT試驗觀察細胞的存活情況,細胞的存活率在95%以上。參照1988年Singh等的方法進行單細胞凝膠電泳試驗。電泳后,經EB染色,用熒光顯微鏡(波長為515~560nm)觀察。每件樣本隨機觀察40個細胞圖像,每組觀察10件樣本,即每組觀察400個細胞,對DNA損傷的程度進行分級,分級標準為:無損傷(0級)、輕度損傷(1級)、中度損傷(2級)、重度損傷(3級)、完全損傷(4級)。參照趙影的方法,計算細胞拖尾率(細胞拖尾率=出現拖尾細胞數/細胞總數×100%)和DNA損傷專用單位。DNA損傷專用單位是一種衡量DNA鏈損傷程度的特有單位,是將不同的分級加以換算統計,得到DNA損傷的總體水平。其計算方法:DNA損傷專用單位=(0×0級細胞數+1×1級細胞數+2×2級細胞數+3×3級細胞數+4×4級細胞數)/細胞總數。2結果2.1大鼠體重測量的結果表1、2可見,各辛硫磷染毒組雄性、雌性小鼠體重與陰性對照組相比,差異均無統計學意義。2.2辛硫磷對小鼠骨髓細胞微核形成的影響辛硫磷對雄性和雌性小鼠的微核誘導作用表現出一致性。辛硫磷染毒小鼠骨髓細胞微核率的變化見表3。表3可見,與陰性對照組比較,10和20mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細胞微核率略有升高,但差異均沒有統計學意義;40和80mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細胞微核率顯著升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠的骨髓細胞微核率均呈上升趨勢。說明辛硫磷對小鼠骨髓細胞微核發生具有誘導作用。辛硫磷染毒小鼠骨髓微核細胞病理圖見封三圖1。陰性對照組小鼠骨髓細胞核為圓形;辛硫磷染毒后小鼠骨髓細胞形成的微核為圓形或橢圓形,大小在主核的1/5以下,微核的染色深度與主核一致或略淺于主核(封三圖1)。2.3辛硫磷染毒小鼠外周血淋巴細胞dna損傷的熒光顯微鏡辛硫磷對雄性和雌性小鼠的DNA損傷作用表現出一致性。辛硫磷染毒對雄性、雌性小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷的變化分別見表4、5。表4、5可見,各劑量辛硫磷染毒組小鼠外周血淋巴細胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均升高,差異有統計學意義(P<0.05)。隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠外周血淋巴細胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均呈上升趨勢。辛硫磷染毒小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷的病理圖見封三圖2。在熒光顯微鏡下,小鼠外周血淋巴細胞DNA被溴化乙啶染成橘紅色。陰性對照組小鼠外周血淋巴細胞DNA呈現規則圓形的熒光頭部(封三圖2A),拖尾細胞以1級損傷(封三圖2B)為主,且拖尾很短。10和20mg/kg辛硫磷染毒組拖尾細胞數顯著增多,拖尾細胞以1級損傷(封三圖2B)和2級損傷(封三圖2C)為主,同時,還出現了3級損傷(封三圖2D)和4級(封三圖2E)損傷,表明小鼠外周血淋巴細胞受到的損傷較嚴重。40和80mg/kg辛硫磷染毒組拖尾細胞數進一步增多,拖尾細胞以1級損傷(封三圖2B)、2級損傷(封三圖2C)和3級損傷(封三圖2D)為主,同時,4級損傷細胞增多(封三圖2E),表明小鼠外周血淋巴細胞受到的損傷嚴重。3辛硫磷對小鼠骨髓細胞微核試驗的影響我國生產的有機磷農藥絕大多數是殺蟲劑,在農業病蟲害防治上起到了重要作用,但也不可避免地污染了周圍環境。農民噴施農藥中毒及人們食用近期噴施農藥的蔬菜中毒事件時有報道,特別是谷物、水果、蔬菜中殘留的低濃度農藥對人體造成的潛在危害是不容忽視的。這些低濃度農藥通過飲食進入人體之后,達到一定劑量時,就可能在分子水平造成DNA損傷或在細胞水平引起染色體畸變,而遺傳物質的改變與致癌、致畸緊密相關。辛硫磷是一種高效低毒、廣譜有機磷殺蟲劑,目前應用于防治水稻、小麥、花生、玉米、棉花、蔬菜、果樹、茶、桑等重要農作物的害蟲,甚至用于防治倉庫害蟲、衛生害蟲和漁業害蟲,應用范圍十分廣泛。辛硫磷的使用量相對較大,其污染也較為嚴重。辛硫磷農藥在環境中的殘留是否會構成對人體健康的危害,一直是學術界關心的環境安全問題。有文獻報道,辛硫磷可使細菌基因突變活力增強,并影響紫菜DNA、RNA和蛋白質合成。陳賢均等研究發現,高劑量辛硫磷可抑制小鼠骨髓細胞增殖,誘導小鼠骨髓細胞染色體結構畸變率增高,可見辛硫磷在基因和染色體水平均表現出一定的遺傳毒性。推測辛硫磷可能導致某些遺傳疾病和癌癥的發生,具有遺傳毒性。本研究首次采用單細胞凝膠電泳試驗與小鼠骨髓細胞微核試驗相結合的方法,評價了辛硫磷對小鼠的遺傳毒性。骨髓細胞微核率試驗結果顯示,與陰性對照組比較,10和20mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細胞微核率略有升高,但差異均沒有統計學意義;40和80mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細胞微核率顯著性升高,差異有統計學意義(P<0.05)。而單細胞凝膠電泳試驗結果顯示,與陰性對照組比較,各劑量辛硫磷染毒組小鼠外周血淋巴細胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。由此可見,與小鼠骨髓細胞微核試驗相比,單細胞凝膠電泳試驗更加敏感,更適用于檢測低毒性低濃度農藥的遺傳毒性。目前,許多國家和組織已將小鼠骨髓細胞微核試驗作為驗證受試物是否具有遺傳毒性的一種標準的體內試驗。本研究的微核試驗結果表明,與陰性對照組比較,40和80mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細胞微核率顯著性升高,差異均有統計學意義(P<0.05);且隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠的骨髓細胞微核率均呈上升趨勢。趙忠桂等研究發現,農滿憶(由氰戊菊酯與辛硫磷混合而成)染毒后,能誘使雄性小鼠睪丸細胞和SD大鼠骨髓細胞微核率升高,且呈現劑量-效應關系;劉秀芳等研究發現,辛硫磷染毒雄性小鼠35d后,各染毒組小鼠骨髓細胞微核率均顯著高于陰性對照組;且隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠骨髓細胞微核率呈上升趨勢,并具有劑量-效應關系。這與本研究結果一致。單細胞凝膠電泳試驗又稱彗星試驗,具有很多優點,與目前已知的各種細胞水平的致突變測試方法相比更加敏感,其在農藥遺傳毒性研究和安全性評價中的應用越來越廣泛。本研究的單細胞凝膠電泳試驗結果顯示,辛硫磷造成了小鼠外周血淋巴細胞DNA的損傷,各劑量辛硫磷染毒組小鼠外周血淋巴細胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均升高,差異有統計學意義(P<0.05);且隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠外周血淋巴細胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均呈上升趨勢。周亞莉等研究發現0.25mg/kg久效磷染毒就可導致小鼠骨髓細胞微核率顯著升高,外周血淋巴細胞DNA損傷程度顯著增加。本研究結果顯示,40mg/kg辛硫磷染毒即可致小鼠的骨髓細胞微核率顯著升高,10mg/kg辛硫磷染毒即可引起小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷程度顯著增加。這說明辛硫磷對哺乳動物具有遺傳毒性作用,但與高毒有機磷農藥相比,毒性作用相對較低。綜上所述,辛硫磷對小鼠具有遺傳毒性,但與高毒有機磷農藥相比,毒性作用相對較低,其機制尚不明確,仍需進一步