淺談酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的技術(shù)要求

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）是一種常見(jiàn)的固相酶免疫計(jì)量法。Engvall和Perlmann于1971年首先應(yīng)用該法定量測(cè)定了IgG。并對(duì)這種方法進(jìn)行命名。ELISA檢測(cè)法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作安全、無(wú)污染和成本低等特點(diǎn)。并且適用于大批量人群抗原、抗體篩查,目前在國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室尤其是缺乏特殊設(shè)備的基層醫(yī)院被廣泛使用。但在臨床檢驗(yàn)中常可見(jiàn)到一些錯(cuò)誤結(jié)果(假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果)。本文就ELISA檢測(cè)操作中的技術(shù)要求及影響因素進(jìn)行了分析。1樣品處理的影響1.1結(jié)果呈假陽(yáng)性凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原,可使結(jié)果呈假陽(yáng)性。解決這個(gè)問(wèn)題可使用加有抗凝劑而不含分離膠的紅色帽采血管;將采集后的血液放入37℃水浴,待充分凝固后再離心分離血清。1.2elisa測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶活性標(biāo)本離心力過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)造成標(biāo)本溶血。溶血的標(biāo)本中血紅蛋白的含鐵血紅素有類似氧化物酶的活性,因此,在含有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的ELISA測(cè)定中,很容易使含鐵血紅素吸附于固相,從而與加入的HRP底物反應(yīng)顯色。因此在試驗(yàn)中建議選擇相對(duì)離心力(RCF)為1000g~1200g,離心時(shí)間為5~10分鐘為宜。1.3血清中igg-igg-gg-g標(biāo)本在冰箱中保存過(guò)久,容易在離心時(shí)造成溶血,另外血清中IgG可聚合成多聚體,導(dǎo)致本底過(guò)深,甚至造成假陽(yáng)性。因此,ELISA檢測(cè)盡量采用新鮮標(biāo)本,或離心后吸取血清保存。2假陰性的檢測(cè)很多實(shí)驗(yàn)室的試劑從冰箱里拿出來(lái)即用。這種做法使試劑在微孔內(nèi)反應(yīng)溫度太低,反應(yīng)不充分,容易對(duì)一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因此,在ELISA測(cè)定中試劑準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái),在室溫下放置30min,使反應(yīng)微孔內(nèi)及試劑的溫度較快地達(dá)到試驗(yàn)所需的溫度。3樣本的額外影響3.1應(yīng)時(shí)間不一致實(shí)驗(yàn)樣本過(guò)多時(shí),加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使得標(biāo)本與陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、質(zhì)控反應(yīng)時(shí)間不一致,從而影響臨界值與標(biāo)本檢測(cè)OD值的一致性,導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)。解決這個(gè)問(wèn)題可分批次操作,從而縮短同批次的加樣時(shí)間,使標(biāo)本與陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、質(zhì)控反應(yīng)時(shí)間盡量相同,減少誤差。3.2滴瓶?jī)?nèi)進(jìn)入空氣量不準(zhǔn)確很多試劑采用滴瓶包裝,可以采用滴加方式,方便操作,縮短時(shí)間。但滴加的角度不同、擠壓的力度不同,甚至滴瓶?jī)?nèi)進(jìn)入空氣量的多少都可以使滴加的試劑量不準(zhǔn)確。而陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照與質(zhì)控常常需要加樣器加注,兩者量的差別也容易使臨界值與標(biāo)本檢測(cè)OD值不一致而導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。為消除這一影響,建議盡量按照試劑盒說(shuō)明量使用加樣器加注,加樣前檢查吸頭松緊度,用吸頭反復(fù)吸打幾次,并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性。3.3懸液器的操作加注同一種試劑時(shí),常常多孔使用一個(gè)吸頭,在繁忙的操作中很容易接觸孔壁污染吸頭,從而污染其他微板孔。這就要求操作者多進(jìn)行操作,練習(xí)懸空加注,掌握正確的操作姿勢(shì)、手法。持握移液器的肘部在操作臺(tái)支撐一下,可以增強(qiáng)手部懸空加注的穩(wěn)定性。另外懸空加注容易產(chǎn)生氣泡,會(huì)減少試劑接觸面積,影響試劑反應(yīng)。這也需要通過(guò)反復(fù)練習(xí)消除其影響。若微板孔中同時(shí)需要加入兩種以上試劑時(shí),加入后要混勻,以利于試劑充分反應(yīng)。4溫育4.1根據(jù)本底反應(yīng)程度所起的作用,選擇最佳溫度和時(shí)間。根據(jù)試劑盒溫育也是ELISA測(cè)定容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。試劑盒確定的一定溫度下的反應(yīng)時(shí)間并不是反應(yīng)的終點(diǎn)。升高反應(yīng)溫度,會(huì)加快反應(yīng),同樣增加時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)反應(yīng),這樣得到的反應(yīng)程度會(huì)比試劑盒確定的反應(yīng)程度高,會(huì)引起陰性高值或假陽(yáng)性。所以要嚴(yán)格根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)選擇溫育時(shí)間、溫度。將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時(shí),孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時(shí)間,如果將微孔板一放入溫箱即開(kāi)始計(jì)時(shí),容易造成實(shí)際溫育時(shí)間縮短,易致弱陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)不出來(lái)。如有備選溫度、時(shí)間段,盡量使用較低的溫度、較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件。4.2周孔顯色較中心孔溫箱溫育時(shí)容易產(chǎn)生“邊緣效應(yīng)”,即ELISA測(cè)定的96孔板中,外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周?chē)着c中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的,因此在溫育時(shí)盡量采用水浴。水浴時(shí)注意水的高度要高出試管架少許,使微孔板底部浸入水中,并盡量減少微孔板重疊。4.3溫育時(shí)盡量覆蓋膠貼試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37℃,這個(gè)溫度下放置30分鐘,微板孔內(nèi)蒸發(fā)的水分會(huì)很多,對(duì)于整個(gè)反應(yīng)體系來(lái)講,各種反應(yīng)物的濃度會(huì)不斷增加,這樣必會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)最后的值升高,因此溫育時(shí)最好覆蓋膠貼。5洗板ELISA測(cè)定的洗板步驟是最主要的關(guān)鍵技術(shù),應(yīng)引起操作者的高度重視。一般有兩種方式,即手工和洗板機(jī)洗板。5.1洗滌劑、轉(zhuǎn)色人為因素較大,實(shí)驗(yàn)人員必須經(jīng)驗(yàn)豐富,加入的洗液量以剛滿反應(yīng)孔為限。注液量太少,孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈;注液量太多,孔與孔之間液體交叉,容易污染。洗滌結(jié)束后扣干亦非常重要,有殘留易造成假陽(yáng)性。拍板時(shí)要垂直,避免交叉污染,用力不能過(guò)猛,防止抗原抗體復(fù)合物脫離。酶結(jié)合物不耐干燥,特別在較高的溫度下更易失活,所以拍干的反應(yīng)板應(yīng)盡量縮短在空氣中暴露的時(shí)間,時(shí)間越長(zhǎng),吸光度值越低。5.2洗板次數(shù)的影響人為因素少,速度快,條件恒定,洗液量注入較準(zhǔn)確。但是使用洗板機(jī)洗板的一個(gè)特點(diǎn)是,每次洗板后不能拍干,故有較多的液體殘留,需增加洗板次數(shù)來(lái)減少這種誤差。但洗板次數(shù)并非越多越好,太多不但浪費(fèi)人力、物力,并且也會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。同時(shí)需要嚴(yán)密觀察,洗液量不足導(dǎo)致洗板不徹底,洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不完全,同樣會(huì)出現(xiàn)誤差。為了洗滌效果好,可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1~2次,能達(dá)到理想的洗滌效果。6光孔的選取讀板時(shí)微板孔中避免存在氣泡,以免假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。讀板時(shí)微板放置應(yīng)平穩(wěn),否則影響與酶標(biāo)儀透光孔的對(duì)齊。讀板前還