elisa方法檢測重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白抗藥抗體

用于高效化學腫瘤互補蛋白注射液（樂福能）的開發由北京杰華生物科技有限公司自主開發。在12個人干預基因（3.0mg）的基礎上，建立了一個復雜的文獻，并使用了高流量篩選技術。將從10萬多萬個克隆中提取的高活性新蛋白由小川編碼和166個氨基酸組成。相對分子量為19.3kg，已獲得美國專利。樂復能在臨床上準備開發用于治療慢性乙型肝炎(CHB),2009年獲得SFDA新藥臨床研究批件。本臨床試驗設計成3組,共入組24例受試者,研究性治療期:6~7周;各劑量組給藥途徑均為肌內注射,于2010年3月正式啟動試驗,2011年11月完成所有受試者的治療與隨訪觀察。藥物的免疫原性是指藥物刺激機體形成特異抗體或致敏淋巴細胞的性質。在臨床試驗中評價免疫原性是生物技術藥物申請臨床試驗和注冊的重要內容。免疫原性的強弱是生物技術藥物開發的決定因素之一。抗藥物抗體可能會中和藥物的活性,影響藥物的清除、血漿半衰期和組織分布,改變藥效/藥動學,使在非臨床研究中觀察到的效應可能并非藥物真正的藥理和/或毒性反應,因此在評價藥物安全性時需同時考察其免疫原性。近年來,隨著大量生物技術藥物的研發,免疫原性的評價成為闡明這些藥物臨床安全性和有效性的關鍵因素。抗藥抗體的檢測是免疫原性研究的重要組成部分,本次研究依據《2010FDADraftGuidanceonImmunogenicityTesting》和《ElisaGuidance》,結合重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液(樂復能)產品的特點,我們建立了樂復能臨床試驗血清樣品抗藥抗體檢測的ELISA方法,并對其進行了靈敏度、精密度和特異性的方法學驗證,然后對試驗各組別的抗藥抗體產生情況作出了初步判斷。材料和方法1重組高效耐藥抗體蛋白注射液原液重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液(北京四環生物制藥有限公司,規格:20μg·mL-1,批號:20090601,20100101,20110303);重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液原液(北京杰華生物技術有限責任公司,蛋白含量1.08mg·mL-1,批號:01/P101206);rhIFN-γ(普欣生物,20μg,Cat.No.Y10606013)。2隆抗體的制備酶標抗體:羊抗鼠IgG-AP(SouthernBiotechCat.No.1031-04);羊抗人IgGFc-Ap(SouthernBiotech,Cat.No.2048-04));靈敏度陽性樣品(委托北京福瑞生物工程公司制備小鼠抗樂復能單克隆抗體,但純度僅為60%,進一步純化,純度達到90%以上,蛋白濃度2.02mg·mL-1);靈敏度陰性樣品(陰性對照品(NC)為正常人血清,共50份中國人血清,由軍事醫學科學院微生物流行病研究所周育森教授贈送,-20℃保存)。待檢樣品(樂復能臨床試驗用藥組23人共92份血清樣品。第1組“d1,10μg·次-1,1次·d-1;d2~d7,停藥;第2~7周,10μg·次-1,1次·d-1”:入組8例受試者,脫落1例;第2組“第1~6周,10μg·次-1,每周3次(隔日1次)”:入組6例受試者;第3組“第1周,10μg·次-1,1次·d-1;第2~6周,20μg·次-1,每周3次(隔日1次)”:入組10例受試者。陽性對照血清:本實驗室長期試用樂復能的2位志愿者用藥1年后的血清;陰性對照血清:本實驗室長期試用樂復能的2位志愿者用藥前的血清。3樣品的制備3.2%聚山梨酯顯色劑P-NitrophenylPhosphateTablets(Sigma,Cat.No.N1891-50SET);封閉液BlockBufferinPBS(ThermoFisher,Cat.No.37515);包被液0.05mol·L-1碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液,pH9.6(Na2CO3:Sigma,Cat.No.S5761-500G;NaHCO3:Sigma,Cat.No.S7795-500G);5mol·L-1NaCl(NaCl:Sigma,S7653);1mol·L-1Tris-HClpH7.2(Tris:GIBCO,Cat.No.15504-038;HCl:Sigma,Cat.No.H1758);樣品稀釋液/洗板液0.05mol·L-1Tris-HCl,含0.1%聚山梨酯20,1.5mol·L-1NaClpH7.2(Tris:GIBCO,Cat.No.15504-038;HCl:Sigma,Cat.No.H1758;NaCl:Sigma,S7653;聚山梨酯-20:Merck,Cat.No.8.17072.1000);NaN3(Sigma,Cat.No.S2002);終止液3mol·L-1NaOH(NaOH:Sigma,Cat.No.S8045);單條可拆酶標板(Nunc,Cat.No.468667);96孔U型細胞培養板(Nunc,Cat.No.163320)。4u3000立地控制系統VERSAmax酶標儀(美國MolecularDevices公司);1575酶標洗板機(美國BIORAD公司);TGL16C臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);GSYⅡ水浴鍋(北京市醫療設備廠);VG3S25旋渦混勻器(德國IKA);VG3S25微型振蕩器(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠);雙人單面超凈工作臺(北京昌平長城空氣凈化工程公司);12道移液器(美國ThermoFisher,30~300μL);電動移液器(美國ThermoFisher,5~50mL)。5在家工作5.1包埋用包被液稀釋重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液原液至0.5μg·mL-1,加入酶聯板,每孔100μL,2~8℃過夜。5.2加入不同的封閉液甩干包被液,在多層紙巾上拍干剩余包被液,立即加入300μL·孔-1封閉液,然后再甩干并拍干剩余封閉液,重復3次,第3次保留封閉液,備用。5.3樣品的制備5.4對照品率及對照率甩干并拍干剩余封閉液,立即加入待檢樣品(每份樣品1孔)、陽性對照及陰性對照(3個復孔)、空白對照(2個復孔),每孔100μL,2~8℃過夜。5.5洗板5.6酶標記抗體用稀釋液1∶300倍稀釋處理后的堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG-Fc,每孔加入100μL,室溫放置1h(25℃左右)。5.7洗板5.8顯色每5mL超純水中加入一片緩沖液濃縮片和一片底物濃縮片,完全溶解后混勻,每孔加入100μL,室溫15min。5.9停止并結束5.10閱讀板結果1elisa檢測限的確定及檢測結果因為目前無法得到純的人抗樂復能抗體,無法精確定量ELISA的靈敏度,本實驗用鼠抗重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白(樂復能)抗體作為參考,以反映該方法的靈敏度。用PBS將鼠抗樂復能抗體稀釋為0.488,0.244,0.122,0.061,0.0305,0.01525和0.00763μg·mL-1。將100μL上述標準樣品加入到預先處理的酶標板中,其酶標二抗為羊抗鼠IgG。計算所得的臨界值所對應抗體濃度即為該方法的檢測限。在檢測對照組或用藥組用藥后的血清時,其ELISA結果均采用每塊微量板上的3孔陰性對照的平均A值的2倍作為臨界值。此種算法是ELISA實驗中臨界值的標準算法,應用此種算法的前提是:使用酶聯儀器讀數時,要預先設定讓儀器讀數時自動減去空白平均值,此時酶聯儀所讀出的數據,適用此種算法。而在實際操作中,沒有預先設定酶聯儀讓儀器自動減去空白空平均值,所以我們的原始數據(A值)含有空白孔A值,因此標準算法不適用,為解決這一問題,在實際計算中,要先將原始數據減去空白孔的平均值,故:臨界值=2×(陰性對照平均值-空白平均值)+空白平均值。鼠抗樂復能抗體系列濃度取log值作為橫坐標,A值作為縱坐標,線性回歸(見圖1)。50份正常人血清檢測結果見表1,臨界值為0.127,所對應抗體濃度是20.4ng·mL-1,因為血清樣品測定時需稀釋10倍,所以用該方法篩選血清樣品的檢測限為204ng·mL-1。2陽性血清各時間復孔確定測定高A值(H,A>1.400)、中A值(M,0.600<A<1.400)、低A值(L,0.200<A<0.600)的陽性血清各1份、陰性血清(N)3份,分別做6個復孔,檢測篩選法批內重復性。結果見表2,所有樣本CV值<5.87%,表明批內重復性好。3d重復測定高、中、低A值的陽性血清(H,M,L)1份、陰性血清(N)3份,分別做2個復孔,檢測篩選法批間精密度。結果見表2,所有樣本CV值<5.81%,表明批間重復性好。3elisa法檢測相關抗體的表達本實驗采用rhIFN-γ為樂復能相關蛋白,觀察其對抗樂復能抗體的檢測是否存在干擾。在高A值(H)和低A值(L)的陽性血清中分別加入50,5.0,0.5μg·mL-1rhIFN-γ,各做4個復孔,含有50,5.0,0.5μg·mL-1的rhIFN-γ測定值分別與含有0μg·mL-1rhIFN-γ的抗體測定值做組間t檢驗,若P>0.05,說明相關蛋白對ELISA篩選樂復能臨床血清樣品的干擾在統計學上無顯著性差異。從表3中可以看出,在ELISA檢測抗樂復能抗體的實驗中,檢測孔中不加入、加入或加入多少rhIFN-γ對最終檢測結果無顯著性改變,表明本試驗所建立的這個ELISA方法特異性好。4檢測a值高于臨界值的標準血清篩選是檢測血清樣品是否含有相應的抗體,即用藥組血清中是否含有抗重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白(樂復能)的抗體。結果通過陰性或者陽性表示,判定標準是該次篩選的臨界值,即檢測A值低于臨界值判定為陰性,檢測A值高于臨界值判定為陽性。待檢血清,陰性對照血清及陽性對照血清用稀釋液10倍稀釋,備用。用洗板液清洗6次。同1.5步。每孔加入20μL的3mol·L-1NaOH,30min內讀板。測定波長405nm作為參比波長。4.1抗體不良反應10μg連續給藥組7例受試者用藥3周后有3例產生抗體,用藥5周后均產生抗體;10μg隔日給藥組6例受試者用藥4周后均產生抗體;20μg隔日連續給藥組10例受試者用藥2周后有1例產生抗體,用藥4周后8例產生抗體,用藥6周后9例產生抗體。4.2受試者抗體陽性檢測待檢樣品通過篩選認定含有相應抗體后,用樣品稀釋液稀釋陽性血清,稀釋方法為:起始10倍,往后依次對倍稀釋至1∶1280,將能夠得到陽性結果的最大稀釋倍數作為該樣品的抗體滴度。23例受試者抗體陽性血清樣本抗體滴度和中和抗體活性如表4所示。各組受試者在用藥后均產生了抗體。樂復能血清抗體檢測我們在預實驗中分別測定3種不同包被濃度樂復能和3種不同濃度標記二抗的排列組合,最終確定樂復能合適的包被濃度為0.5μg·mL-1,100μL·孔-1;堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG-Fc(二抗)合適的應用濃度為1∶300。選擇該組合的依據是臨界A值<0.2,50份陰性血清均被判為陰性,且陽性對照A值>1.2。無論多克隆抗體還是單克隆抗體,對同一抗原的親和力相差極大,應用抗原蛋白-小鼠單抗-酶標抗鼠IgG標準曲線來計算抗原蛋白-人血清抗體(混合)-酶標抗人IgG的最低檢測限只能參考。但從特異性和精密度結果來看,本實驗建立的ELISA方法檢測樂復能血清抗藥抗體的特異性和重復性良好。Lok等和Porres等研究發現,接受小劑量干擾素治療的患者,抗干擾素抗體產生率明顯高于接受大劑量干擾素治療的患者。體內實驗和離體實驗均證明低劑量干擾素可促進抗體形成,高劑量干擾素則