中藥提取的原理與實現

作為中醫學現代化的基本步驟和重要因素，該過程的成功及其對后續環節和最終治療效果的影響越來越受到重視。其主要評價標準除了提取物收率高低、有效成分含量多少及表現出的療效強弱外,快速、節能、安全、方便和環保即成為最為重要的因素。其中的安全包括兩方面的內容,即操作安全和成分不被破壞。傳統提取方法如煎煮法、回流法、連續回流法、浸漬法、滲漉法等已被人們熟知,超聲波提取法、微波提取法及超臨界萃取法等漸被人們接受,其優缺點及應用潛力正在經受實踐的檢驗。近年來,最新用于研究的組織破碎提取法及閃式提取器經過十余年的初步實踐已顯示出獨特的優勢。本文將對組織破碎提取法的創制與實踐進行簡要介紹,尤其是對其特性、優缺點及發展前景作一較客觀的比較分析,以期對致力于中藥現代化研究的同行有所參考。植物組織破碎提取法作為中草藥化學及相關學科中一種科學的提取方法于1993年首次提出,當時是利用日本岡山大學奧田拓男教授所贈送的日本三菱JM-E31型混合器而完成的,這一儀器其實就是現今十分流行的家用果汁機。由于該儀器是專用于鮮果軟組織打碎混合的目的,所用材料也多不耐有機溶劑,所以當時只能對植物葉類、部分鮮果、鮮根及非韌性全草進行提取。通過試驗,取得了可喜的效果,尤其是提取速度和室溫進行所體現的優勢優于所有方法。在河南省教委的支持下,與洛陽工學院章琛教授等合作,自主研制出了首臺能用于硬組織破碎提取的樣機并用于實踐。之后,相繼試制數臺陸續被國內部分學校及研究機構所采用。但由于隨后技術升級、市場運作及相關人員相繼出國而擱淺。毫無疑問地說,如果沒有這一方法和與之呼應的提取器,近十余年對花葉、訶子、柳蘭、鬼燈檠、千屈菜、桃金娘等中草藥中丹寧、多元酚類化合物的研究幾乎是不可能的。實踐不僅充分驗證了這一方法和儀器在中草藥丹寧與多元酚類化合物研究方面的優越性,同時還展示出了在其他多類化合物方面的潛在優勢和與其他方法相比所顯示出的無可比擬的特性。為了能對組織破碎提取法和閃式提取器具有更好的了解和應用,現將從其基本原理、基本結構、優勢分析及應用實例作簡要介紹。1溶劑、藥劑和提取在中草藥常用提取方法中,除了專屬性強的壓榨法、升華法和水蒸汽蒸餾法外,所有方法都與溶劑有關,故又統稱為溶劑提取法,在溶劑提取法中影響提取效率的主要因素有溶劑(介質)的性質、物料的性質、外力的影響和介質的溫度。無論是植物的初生代謝成分(糖類、脂類、蛋白、激素等)或次生代謝成分(生物堿、黃酮、苷類、萜類等)和異常次生代謝成分(如樹脂、樹膠等),在植物體內多是以分子狀態存在于細胞內或細胞間的,少數以鹽的形式(如生物堿、有機酸)、結晶形式(如草酸鈣結晶)、分子團形式(如五倍子丹寧)等存在,當與其周圍的新鮮溶劑介質相比,植物組織內外濃度差無限大,此時,隨著時間的延長,溶劑將自動向植物細胞內滲透、充盈甚至破壞細胞膜而徹底打開內外通道,同時細胞內的成分因溶劑分子的滲入、包圍而使細胞內的原存狀態解離并開始向低濃度的細胞組織外擴散,經過一定時間即達到內外平衡,此時過濾,即是前所述及的浸漬法。在這一過程中,溶劑的選擇極為重要。可以想像,如果用水去浸泡花生、大豆中的油脂是幾乎不可能的,同樣用石油醚等非極性溶劑去提取各種植物中的多糖也是完全無效的。除了溶劑本身的滲透能力外,各種溶劑的溶解特性起關鍵性作用。對于通常所講的“相似相溶原理”可以用圖1更好地表現出來,圖的中心代表中等極性溶劑,該類溶劑一般既可以溶解出極性成分,又可溶解出非極性成分。當溶劑極性增強時,所溶出成分的極性也增強,同時極性成分增多,非極性成分減少,當達到足夠強時,將不再溶出非極性成分;同樣,當溶劑極性減弱時,所溶出成分的極性也減弱,同時非極性成分增多,極性成分減少,當達到足夠弱時,即完全非極性溶劑時,將不再溶出任何極性成分。在所選溶劑的極性決定后,影響提取效率的因素就剩物料粒度、外力作用和介質溫度了,其中介質溫度影響的一般規律是溫度越高,分子運動速度加強,從而使達到植物組織內外平衡的時間縮短,即提高提取效率。如煎煮法、回流提取法即是這一原理。但值得注意的是,有些植物成分在一定溶劑中隨溫度升高而溶解度降低,如葛根素(puerarin)在甲醇溶劑中隨溫度升高而溶解度降低,這一現象在提取時應引起注意。此外,有些成分在一定溶劑中受熱分解或變性,如含淀粉多的材料用水做溶劑提取時,加熱可使淀粉糊化而阻礙一些成分的繼續溶出和影響過濾。加熱提取丹寧類化合物也易造成成分分解和氧化破壞。因此,利用加熱縮短平衡時間,提高提取效率的得失兼具,需依具體情況具體考慮。物料粒度和外力作用也是影響平衡時間和提取效率的關鍵因素,其中物料粒度雖然可通過粉碎來實現,但實際應用仍有不少限制與不便。如對于根、莖、葉、花果等不同質地的藥材需要不同的粉碎方法,對新鮮藥材更需要特殊的粉碎方法。對于像熟地、玄參等的粉碎幾乎是不可能的。另外,粉碎過細又會對后期的過濾帶來很大麻煩,尤其是當用水作溶劑時就更為突出。因此,靠粉碎來縮短平衡時間、提高提取效率的可行性十分有限。在溶劑和物料粒度決定之后,外力的作用即成為影響提取效率的關鍵因素。如前述的超聲波、微波、磁輻射、超臨界動態連續萃取、高壓連續滲漉罐及通過進一步改進可實現的攪拌浸漬法、振動浸漬法等,這些方法均在某些方面有一定改進,但均未實現重大突破,甚至是提取效率的顯著提高。此外,溶劑用量大小也是一個很矛盾的因素,溶劑用量小,顯然可很快達到組織內外平衡,但同時也因過早飽和作用而影響提取收率,此時,往往需要多次重復提取方可達到完全。如溶劑用量過大,一是造成直接浪費,二是達到平衡的時間顯著延長,同樣影響提取效率。因此,組織破碎提取法和閃式提取器方可以嶄新面貌面世并給中藥提取領域帶來革命性變化。2破碎顆粒尺寸對組織平衡的影響由上述對影響提取效率的因素進行的分析即可看出,物料粒度越小,溶劑與被提取的成分極性越接近,適當外力作用越突出,提取效率就會越高。組織破碎提取法通過閃式提取器的巧妙設計,在適當溶劑存在下,將物料高速粉碎至適當粒度,同時伴有高速攪拌、振動、負壓滲濾等外力,實現了這3種因素的最佳結合,達到了充分提高提取效率之目的。在這一過程中,為了在既能充分發揮粒度小易達到組織內外平衡的優勢,又不至于因顆粒度太細而影響后期的過濾,故在破碎刀具的設計方面控制了破碎顆粒范圍在40～60目左右。由于這樣細小的顆粒與溶劑在一起,在高速攪拌與振動下,組織內外的化學成分在極短的時間內即可達到平衡。因此,完成一次提取一般在1min之內即可,藥渣在抽濾過程中略經洗濾即可達到提取基本完全的目的。3動物組織勻漿化根據前述組織破碎提取法的基本思想,閃式提取器由破碎刀具、動力部分、升降系統、控制系統及物料容器所組成,其中破碎刀具和動力部分為關鍵部件。破碎刀頭的設計充分吸收了用于動物組織勻漿化的均質器的優點,避免了普通組織搗碎機的單刀切碎,“欺軟怕硬”的不足。內外刃之間保持0.5～1mm間隙,這一間隙的大小不僅決定了破碎顆粒度的大小,而且影響雙刃間的切割效率與鋒利性。雙刃通過精密的同心軸相連,外刃固定,內刃在高速電機的帶動下旋轉,從而對被破碎的材料產生破碎作用(見圖2)。本儀器的動力部分是由單相高速電機完成,根據破碎刀具的大小配置不同功率,電機通過電阻或電壓控制系統實現無級連續變速或階梯檔位調速。物料容器采用配套且具密封裝置的耐有機溶劑材料制成,也可用適當容器替代。4閃式提取器啟動點完成一次提取一般在30s左右,其速度與任何傳統方法相比,可說是眨眼功夫,因此被稱之為閃式提取器。對其進行仔細剖析,不難發現整個過程包含了以下基本原理:4.1研磨對不同粒徑中草藥根、莖的研磨本儀器內刃的轉速為15000～30000r·min-1。可以想像,對于100g的中等脆性的中草藥根、莖等飲片,在普通研缽或碾槽中,手動反復研磨15000遍,將會是如何細碎的程度,但達到這一目的即使在不停的情況下(2次/s),可能要花2h以上,而本儀器僅需不足1min。4.2外對于進行攪拌在內刃高速轉動并與外刃間發生切割作用過程中,在內刃中心形成強力渦流,并帶動已粉碎的物料內外翻動,從而產生劇烈攪拌作用,使整個體系處于快速的濃度變化之中。物料中被提取的物質分子隨著破碎顆粒的變小而暴露于溶劑環境中并迅速轉移至溶劑中,提取溶劑與物料顆粒間化學成分的分布隨著破碎的進行在平衡、不平衡之間快速交替進行,最終達到徹底粉碎、完全平衡的提取。4.3渦流負壓的作用原理在工作狀態,整個體系處在一個高速動態體系之中,內外刃之間不僅發生了對物料的剪切作用,同時借助內刃旋轉、外刃固定而產生一種渦流負壓,在這種負壓的作用下,在外刃窗口的內外發生分子滲透現象,即已通過剪碎而充分暴露的物質分子(被提取成分)在負壓的作用下,被溶劑分子包圍、解離、替代,最后脫離藥材進入溶劑中而實現提取的目的。4.4壞作用及對改變一種分散體系的作用超聲波對浸漬法的加速作用早已被公認,振動對植物組織間結構的破壞作用及對改變一種分散體系的作用也不言而喻。本儀器在高速旋轉中能夠產生相當于超聲波1/60的振動,在這種振動作用下,無疑對達到化學成分在被破碎物料顆粒內外的溶解平衡起到強力促進作用。5粉碎提取的必要性簡單從表面來看,不難有這樣的疑問,即可以先用普通粉碎機把藥材粉碎,然后再用浸泡或攪拌浸泡的方法進行提取。這種想法僅從一種因素考慮當然可以適當提高效率,但略作分析,二者本質不同即不難看出:(1)從操作來看,就一般材料粉碎而言,至少需要一個適當大小的粉碎機,而這種粉碎機要同時適合軟、硬材料、新鮮材料、肉質材料、韌性材料等的需要幾乎是不可能的。(2)對于易粉碎的材料,粉碎后往往形成大量細粉,而這種細粉無論再用什么溶劑提取都會對后期過濾帶來極大麻煩。(3)對粉碎后的物料提取如采用浸漬法,就必然再加上攪拌裝置,否則,被粉碎的物料要么漂浮在表面,要么沉在底部,靠自然力量實現藥材內外被提取成分在短時間內達到濃度平衡是幾乎不可能的,至少失去了粉碎的意義。如果用于滲濾或回流提取,則前者極易域被細粉堵塞而滯留,后者則會因細粉沉底而爆沸甚至危險。(4)從提取的時間效率來說,后者無論如何費時都會比前者高數百倍以上,如果用于生產,由時間與人力所造成的損失將為數倍至數百倍之多。(5)按后者最簡單的操作程序來評價,至少需要兩件動力設備,即粉碎機和攪拌機。此外,尚需要各自的配套器具,而破碎提取器僅相當于其一。(6)從環境保護分析,破碎提取占用空間小,設備簡單,無粉塵污染,而后者與其則完全相反。6閃式提取器的優越性能6.1在省級范圍內在一定規模情況下,完成一次提取僅需30s左右。6.2在室溫下提取，沒有損壞本儀器一般在室溫條件對物料進行提取,避免了任何不耐熱成分破壞的可能性。必要時可采用定制的加熱容器,或使用預熱的溶劑。6.3花種子本儀器可用于各種植物的根、莖、葉、花、果實、種子(細小的種子除外)等,一般在預粉碎至普通中藥飲片大小,新鮮材料、堅硬材料、韌性材料等均可。6.4提取主要苷類成分根據成分的性質不同,選用不同溶劑,如提取糖類、蛋白、多肽、氨基酸等可用水作溶劑,提取黃酮等各種苷類成分可用乙導或含水乙醇,提取丹寧及多元酚類成分可選用不同濃度丙酮進行。6.5按安全注意事項常采用水、乙醇、甲醇、丙酮等槳它們的含水溶劑,一般以既能提取出所需成分,又適于后期過濾為宜。對于乙醚、乙酸乙酯等易燃有機溶劑一般不宜選用,必要時嚴格按易燃有機溶劑的使用注意事項在通風、安全的地方進行。提取生物堿需用酸水時,應先用常水破碎提取,然后再加入適量酸調至所需酸度,攪拌過濾即可,以免對刀頭產生腐蝕作用。6.6閃式提取的用量按提取100g中等硬度的根類藥材計算,用常規加熱回流提取,一般用500W電熱套或電爐作為熱源提取2次,每次1h,總耗電為1kW·h-1,即一度電。若用閃式提取器提取,可在20s完成,按800W功率計算,即20÷3600×0.8=0.004度,僅為前者的1/250,如果擴大至中試規模或生產化規模,其節約程度將十分顯著。對于松散軟材料如葉、花、全草類,由于其質輕而在常規提取中將浪費巨大空間及相應溶劑用量,而用閃式提取器則會在瞬間將其變為漿粉,且可在提取過程中分次加料直至物料/溶劑比合適為止,從而可發揮出閃式提取器的巨大威力。比起超聲提取也要快數十倍之多。6.7避免了流提取中熱源的進一步提取本儀器不僅是單人按鍵式操作,避免了回流提取中在燒瓶內裝掏藥渣的苦惱,也避免了煎煮法中熱源控制及長時間看守的不便。但仍應嚴格按照操作規程進行操作。6.8閃式提取器主要特點前已述及,與先粉碎后提取相比,避免了空氣粉塵的污染;與回流提取法相比,掏取藥渣時有機溶劑易對人體造成一定傷害,且易在藥渣內殘留大量溶劑對進一步處理造成困難。用閃式提取器只需抽濾即可把大部分殘留有機溶劑除去,少量殘余可通過抽濾出提取液后用適量水抽洗即可。基本除盡溶劑在藥渣中的殘留。除凈溶劑的粉碎藥渣可視能否再利用情況參與自然生態循環。7功能性材料的選擇由于受提取容器大小、動力的額定功率及破碎刀具臂長的影響,對于目前市場上的JHBE-50S型閃式提取器單次提取量受一定限制。對于質地硬脆、密度大的干果、根莖飲片類,一次可提取100～300g,但對于密度小、蓬松的葉、花及全草類,由于體積大,故單次加入藥材量就小。但無論什么材料,均可通過分次加入而達到所希望之目的。對于非飲片、質地堅硬的根及根莖、干果類等應先加工成飲片大小或適當打碎,否則因無法進入內外刃之間而使破碎無法進行。有時會因使用不當而造成刀頭被卡現象,此時應立即停機按操作說明及故障排除方法處理即可。當用水作溶劑時往往會因水溶性成分太多、粘稠性增大及混懸、乳化現象等而使過濾困難,此時可依所需成分特性進行處理,如先用紗布粗濾去藥渣再精濾,或用適當有機溶劑如乙醇處理等。正像任一處方難包治百病一樣,閃式提取器尚無足夠證據或傾向完全替代目前的提取方法。對于各種復雜多變的情況應靈活處理,更尚需長時間的摸索檢驗。8中低頻旋轉電機的價值前已述及,自從早期的家用果汁混合器、第一代試制的中低速旋轉電機到目前的標準化產品,曾對數10種中草藥進行了實用性研究與試驗,下述部分實例將會對本法的優勢及實用價值作以充分說明。8.1提取方法比較花葉為金縷梅科木屬植物花或木(Loropetalumchinense)的干燥葉。具有清熱止瀉、活血止血的功效。用于治療暑熱泄痢、扭閃傷筋、創傷出血、目痛喉瘡等癥。HPLC初步分析表明,其中含有豐富的丹寧類化合物,為了闡明其丹寧及有關多元酚類化合物的結構及生物活性,受國家青年科學基金資助對其進行了較系統研究。由于丹寧類化合物的不穩定性,首先對其提取方法進行了摸索試驗,同時進行試驗的還有芫花葉等6種材料。由于被試材料均為干燥葉類,故本研究采用了日本產三菱JN-E31型混合器,對所選用的6種植物材料分別用95%EtOH和70%Me2CO作溶劑進行室溫破碎提取,同時選用回流提取法中的最佳條件進行回流提取作為對照,將二法所得干燥提取物的收率和TLC行為等進行比較分析,從而說明破碎提取法的優越性。所選用的6種試驗材料分別為:(1)芫花葉(Daphnegenkwa),主要含有黃酮及綠原酸類化合物;(2)長白瑞香葉(D.koreana),主要含有香豆素類化合物;(3)柳葉(Salixbabylonica)含有黃酮類化合物;(4)尖瓣瑞香(D.acutiloba)含香豆素類化合物;(5)木瓜葉(Chaenomelessinensis)含丹寧類化合物;(6)算盤子葉(Glochidionpuberum)含丹寧類化合物。研究結果表明:1)當用70%Me2CO作溶劑時,6種材料分別用兩法所得干燥提取物的收率幾乎一樣。由于破碎提取僅用1min完成,且不需加熱,而回流提取1次就需要2h,因此就等于提高效率100倍以上,且節約了大量能源。2)在2種方法中,70%Me2CO比95%EtOH對所用的6種材料及所含成分來說,具有更強的穿透性和溶解能力,收率遠高于后者。因此,對于上述材料中成分的提取來說,以首選70%Me2CO為宜。3)將兩法所得各提取物進行初步TLC比較分析,結果基本一樣。由于丹寧類成分即使受熱破壞也很難在普通TLC上顯示,但破碎提取法中由于避免了加熱,其安全性是十分可靠的。因此,對花葉中丹寧的提取主要采用了這種方法,效果十分滿意。總提取物收率達到25%以上,HPLC分析顯示該提取物由大小不同的可水解丹寧分子組成,經Toyop-earlHW-40和MCIgel反復分離純化,從中分離鑒定了30余個可水解丹寧及多元酚類化合物。尤其是從中分離到了由可水解丹寧單元體(如rugosinA等)、二聚體(如rugosinD等)和三聚體(rugosinG等)及具大環結構的可水解丹寧(oenotheinB)等組成的一系列化合物。從所證明的結構本身即可充分顯示該提取方法的安全性。8.2化學、機械化學成分訶子為使君子科(Combretaceae)訶子屬植物訶子(Terminaliachebula)和毛訶子(T.billerica)的干燥果實,具有清熱解毒、收斂養血、調和諸藥的功效。作為國家九五攻關期間80味藥材質量標準化的內容之一,我們曾對在廣西、云南等我國主要產地采集到的訶子樣品、各大藥材市場和部分院校收集到的樣品進行了鑒定及成分分析,對廣西產的當年干燥訶子進行了系統化學成分研究。取干燥去核訶子4.5kg,用自行研制的閃式提取器和以含水丙酮作為溶劑進行室溫破碎提取,提取液減壓濃縮至干后得總提取物1.5kg。對該提取物進行的初步化學分析和HPLC分析勻顯示有豐富的丹寧及多元酚類成分。對其進行DiaionHP-20,ToyopearlHW-40反復柱層分析,分離得到20余種成分,其中訶子酸(chebulinicacid)和訶黎勒酸(chebu-lagicacid)為其主要成分。同樣提取方法對其進行HPLC定量分析表明,訶子酸和訶黎勒酸的含量分別為7.28%和13.06%。進一步的總提取物的收率研究表明,對1.02g藥材用150mL70%丙酮進行破碎提取,每次提取20s,提取液減壓抽干,4次所得提取物及收率分別為第1次0.387g(38.7%),第2次0.110g(11.0%),第3次0.021g(2.1%),第4次僅為0.004g(0.4%)。前3次的提取效率分別為74.7%,21.2%和4.1%。因此,從經濟角度考慮,提取2次即可達到95%以上。可見對于像訶子這樣極硬的藥材,破碎提取則更加顯示出其具大威力。8.3含水率丙酮ecg綠茶中主要化學成分多為水溶性或中等極性,這些成分包括多元酚、氨基酸、糖類、咖啡因等堿性成分及微量元素等,其中的多元酚即常所稱之的茶多酚主要由4種化合物組成,分別為表兒茶素(epicatechin,EC),表兒茶素沒食子酸酯(epicatechingallate,ECG),表沒食子酰兒茶素(epigallocatechin,EGC)和表沒食子酰兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG),其中尤以EGCG含量最高,且為綠茶中防癌的主要成分。盡管這些成分都具有較好的水溶性,但考慮到對茶多酚提取更加充分和后期處理的方便,故采用了含水丙酮作為提取溶劑。本研究用普通信陽毛尖綠茶作為原料進行室溫組織破碎提取,3次提取收率的總和達50%以上,3次提取之間的比例基本為9∶3∶1,說明2次提取即已基本完全,如在抽濾過程中再用適量新鮮溶劑沖洗,則會達到更好的效果。8.4元酚類化合物柳蘭為柳葉菜科(Onagraceae)植物柳蘭(Chamaenerionangustifolium)的干燥全草,具有治療乳汁不下、腸燥便秘、月經不調、骨折及關節扭傷的作用。曾有報道其中含有的大分子多元酚類化合物具有抑制小鼠移植瘤生長的作用。為了闡明其主要化學成分及可能的抗腫瘤作用,受國家自然科學基金資助對其進行了系統研究。對采自湖北神農架的該植物干燥地上部分2kg以含水丙酮和閃式提取器進行破碎提取,減壓濃縮去除丙酮后直接進行DiaionHP-20柱層析,對不同濃度甲醇洗脫部分再進行ToyopearlHW-40和MCIgelCHP-20P反復柱層析,分離鑒定出包括黃酮苷、綠原酸、小分子酚類化合物及可水解丹寧單元體和二聚體的18種化合物,其中,woodfordinI在引起人白血病K562細胞凋亡方面顯示出非常好的作用,有望成為進一步開發用于人CMLK562細胞的先導化合物。8.5治療冠心病疾病桃金娘(Rhodomyrtustomentosa)為桃金娘科藥用植物,主要分布于南方各省,其根(山稔根)具有祛風除濕、止血、止痛的功效,主要用于治療肝炎、血崩、胃痛、風濕性關節痛、疝氣及傳染性肝炎等癥。受國家自然科學基金資助,對其化學成分進行了系統分離鑒定。對初步砸碎的桃金娘根用閃式提取器和含水丙酮進行破碎提取,同前述方法共分離得到10余種C-苷可水解丹寧及其他黃酮、多元酚等類型成分,其中castalagin、casuarinin、tomentosin、楊梅素-3-O-葡萄糖苷(myricetin-3-O-glucoside)為其主要成分。8.6強調黃酮苷類活性成分的檢測芫花葉為瑞香科植物芫花(Daphnegenkwa)的干燥葉,在我們對其進行系統化學成分研究過