曼氏無針麝香scddna基因克隆及序列分析

脂肪酶（scd）是去除脂肪酸的重要速度酶，能夠誘導飽和脂肪酸coa9-cis的飽和，并生成單飽和脂肪酸（mcs）。主要底物為棕櫚樹科a（c16:0）和硬脂肪樹科a（c18:0），scd將它們轉換為棕櫚樹科a（c16:1）和油脂酸coa（c18:1）（嚴廣春等，2007）。棕櫚油酸鹽與油酸鹽是膜磷脂、膽固醇脂、甘油三酯、脂蠟中MUFAs的主要組成部分,而這些脂類中MUFAs與飽和脂肪酸(SFAs)的比例影響脂蛋白代謝、信號傳導和生物膜流動性,因此SCD近來成為脂肪代謝研究的熱點。曼氏無針烏賊(Sepiellamaindroni)曾為東海區的四大海產之一,具有較高的藥用、營養和經濟價值。20世紀90年代后,隨著資源的大量開采和生態環境的破壞,東海區曼氏無針烏賊的數量明顯衰退,產量急劇下降(吳常文等,2010)。為恢復曼氏無針烏賊野生資源,眾多研究者針對曼氏無針烏賊胚胎發生(常抗美等,2009)、營養(符方堯等,2005)、生理生態以及繁殖生物學(張建設等,2011)等方面開展了比較全面的研究,但對于該物種的SCD基因及其相關功能還未見報道。本文以曼氏無針烏賊為研究對象,通過分子生物學及生物信息學手段,探討其SCD基因保守區段的基因結構和相關功能片段,闡明其在曼氏無針烏賊中可能存在的生物學功能,為其脂肪酸代謝研究奠定理論基礎。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗動物1.1.2aqna聚合酶和pd18-tvectorRNAisoPlus、RNALAPCRTMKit(AMV)Ver1.1、TaqDNA聚合酶、pMD18-TVector、E.coliDH5α購自寶生物大連有限公司;SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit購自Clontech公司;DNA凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司。1.2總rna提取從活的成體曼氏無針烏賊中取50—100mg肝臟組織放入液氮速凍后立即放入TRIZOL(Invitrogen)勻漿,按RNAisoPlus說明提取總RNA。cDNA合成按照RNALAPCRTMKit(AMV)Ver1.1試劑盒推薦的方法進行。1.3ddho學習條件根據已報道的不同物種SCD的氨基酸序列保守區設計曼氏無針烏賊SCD基因引物,序列如下:PCR反應10μL體系0.5μLMg2+(25mmol/L),1μLBuffer(10×),0.5μL上下游引物(10μmol/L),0.3μLTaq酶(1U/μL),1μLdNTPs(10mmol/L),6.2μLddH2O下按照以下條件進行:95℃預變性5min;94℃30s,52℃30s,72℃35s,35個循環;72℃延伸12min。PCR產物以QIAGEN公司的DNA凝膠回收試劑盒回收純化后,與pMD18-T載體連接,轉化至E.coli5α感受態細胞,PCR檢測后將陽性克隆送上海英駿公司進行測序。1.4racepcr檢測依據前一步驟獲得的SCDcDNA序列的核心片段及5′RACESystem試劑盒要求,設計5′RACE引物GSP-1:5′CAGGATCGTTGAGCAA3′、GSP-2:5′TGC-CTTTGGCTCTCACATTAG3′,GSP-3:5′GGAGAAG-AAGAAGCCACGTTT3′。5′RACE的操作按照試劑盒推薦的方法進行,以引物GSP-2與試劑盒內橋連鉚釘引物AAP對已經加dC尾的cDNA進行PCR第一輪擴增,另以引物GSP-3和試劑盒內橋連通用擴增引物AUAP進行巢式PCR第二輪擴增。3′-RACE上游引物3′122-1:5′AGTTGGTGTTGGGATGAAAGTCTGT-GG3′,3′122-2:5′GAATCTTGCGCTATTGTTGTGGC-CTGA3′,以引物3′122-1與UPM,進行第一輪touchdownPCR擴增;再以引物3′122-2和UPM進行第二輪touchdownPCR擴增,上述PCR擴增條件參考試劑盒上說明進行操作。RACE產物純化克隆和測序方法同1.3步驟。1.5曼針酪氨酸基因的序列分析2結果與分析2.1dna的獲得以曼氏無針烏賊肝臟cDNA為模板,以P1和P2為引物擴增得到300bp的片段(圖1,左),與預期大小一致。將產物電泳回收、純化后克隆至pMD18-T載體,并送往上海英駿生物技術有限公司測序,得到314bp的cDNA片段。根據已克隆的曼氏無針烏賊肝臟SCDcDNA核心片段設計引物,進一步利用5′RACE和3′RACE技術分別獲得2個大小分別為700bp和600bp的PCR產物(圖1中、右)。2.2bp的編碼測序拼接確定曼氏無針烏賊SCDcDNA全長為1513bp,其中5′非翻譯區(5′UTR)為261bp,3′非翻譯區(3′UTR)為331bp,開放閱讀框(ORF)為921bp,編碼306個氨基酸(圖2)。2.3曼氏無針麻黃氨基酸序列及進化支次的分析以ClustalX軟件將曼氏無針烏賊與其它親緣關系較近的真蛸(Octopusvulgaris)、長牡蠣(Crassostreagigas)、鱸魚(Dicentrarchuslabrax)、虱目魚(Chanoschanos)(Hsiehetal,2001)四個物種進行氨基酸序列比對,結果發現曼氏無針烏賊與上述四個物種氨基酸序列高度保守,同源性較強(圖3),其中曼氏無針烏賊與真蛸和長牡蠣的相似性高達91%,同虱目魚的相似性為90%,與鱸魚的相似性為89%。采用MEGA4.0將曼氏無針烏賊與真蛸(O.vulgaris)、長牡蠣(C.gigas)、原鴿(Columbalivia)、火雞(Meleagvisgallopavo)、鱸魚(D.labrax)、小點貓鯊(Scyliorhinuscanicula)、虱目魚(C.chanos)、綠海龜(Cheloniamydas)、黑猩猩(Pantroglodytes)、野豬(Susscrofa)10種動物及人(Homosapiens)的SCD氨基酸序列構建系統進化樹,結果如圖4。頭足類的SCD與牡蠣等軟體動物明顯位于同一進化支,其中同屬于頭足類的曼氏無針烏賊和真蛸,位于同一個分支,證明其親緣關系最接近。曼氏無針烏賊的SCD氨基酸序列與其它動物亦呈較高相似性,說明該基因在進化上較為保守,在各種動物中均擔任脂肪酸代謝的生理功能。2.4曼針酪氨酸酶scd基因的生物信息分析2.4.1物理和化學性質分析2.4.2scd蛋白三級結構分析蛋白二級結構分析與三級結構預測二級結構分析發現SCD蛋白含有45.10%的螺旋9.48%的延伸鏈和45.52%的無規則卷曲,其中二級結構特征與已克隆出的鵝的SCD基因極為相近(付曉英2010)1),通過同源建模構建SCD蛋白質三級結構圖顯示曼氏無針烏賊SCD蛋白含有四個α螺旋(圖5)推測其可能為跨膜結構域的組成成分。3曼氏無針麻黃scd基因的進化分類硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoy-coenzymeAdesaturase,SCD)是脂肪酸去飽和化的關鍵酶,與作為體內能量重要來源和膜的重要組成成分的多不飽和脂肪酸(PUFA)共同維持膜流動性,并在脂肪酸代謝中起中心調節作用(Ntambi,1999)。本研究克隆獲得曼氏無針烏賊SCDcDNA全長1513bp,其中5′非翻譯區(5′UTR)261bp,3′非翻譯區(3′UTR)331bp,開放閱讀框(ORF)921bp,編碼306個氨基酸,為堿性蛋白質。預測獲得的曼氏無針烏賊SCD蛋白序列同已報道的其它物種的SCD具有較高同源性,對曼氏無針烏賊、真蛸(Monroigetal,2012)、長牡蠣的氨基酸序列進一步比對分析發現,同源性高達93.47%—90.12%,說明SCD在軟體動物中的結構相對保守,與其它非軟體動物SCD氨基酸同源性亦較高,達到50%以上,說明SCD分子在進化分類上比較古老,可能是由同一祖先進化而來。分析不同物種SCD基因的系統進化樹可知,曼氏無針烏賊和真蛸及長牡蠣進化關系最近,與魚類稍遠,與人及大鼠等哺乳動物親緣關系最遠。因此,根據不同物種SCD基因序列構建的系統進化樹能較真實地體現曼氏無針烏賊SCD基因的分類地位,也反應了SCD基因在各物種中可能執行相近的功能,即參與脂肪酸代謝。利用核酸、蛋白質分析軟件,從分子水平對SCD氨基酸序列的結構特征進行分析發現,SCD為疏水蛋白質,含有4個跨膜區域,從42—91號氨基酸殘基、188—239號氨基酸殘基,各含兩個跨膜區,與鵝SCD蛋白類似(付曉英,2010)1),但不同于蝦夷馬糞海膽SCD基因(三個跨膜區)(丁君等,2012)。一般跨膜結構域包括α-螺旋和β-折疊,以α-螺旋為主,固著于細胞膜上起錨定作用,曼氏無針烏賊SCD蛋白含有45.10%的螺旋,可能作為膜受體發揮作用,也可能作為定位于膜的錨定蛋白或者離子通道等來起相關作用。曼氏無針烏賊SCD蛋白不存在剪切信號,但含有多個位點可以發生磷酸化修飾,個別位點可以發生糖基化修飾,表明該蛋白可能只存在于細胞質中發揮作用,而不分泌到細胞外,蛋白質的脫磷酸化和磷酸化在細胞信號傳導中起到重要作用,SCD蛋白中的多個磷酸化位點可能是其完成生理功能的結構基礎(deCastroetal,2006)。在哺乳動物、真菌、藍細菌、昆蟲及高等植物中的膜脫氫酶的一級結構中含有三個富含組氨酸盒模序的保守區域,推測是作為酶當中的鐵離子配體發生作用,定點誘變技術檢測發現,小鼠Δ9脫氫酶的8個保守的組氨酸殘基對于催化作用必不可少,作者的研究結果表明曼