木霉的分離純化及其對病原菌的抑制作用

木霉是一種具有重要使用價值的抗生性菌。根據(jù)大量研究，某些該屬的植物對各種植物病原體有抗逆作用。它對抗逆作用和機(jī)制的研究也很多，通常被認(rèn)為是重復(fù)使用、抗生作用和競爭作用。木霉作為生物防治的優(yōu)勢菌在植病生防中的應(yīng)用潛力越來越受到重視,本研究報道了從土壤中分離純化的木霉菌株,研究了其對兩種常見土傳植物病原菌的拮抗作用。1材料和方法1.1土壤中的木霉種群的分離和純度1.1.1不同濃度土壤懸浮液的分離純化在淄博郊區(qū)5個不同小麥地里分別取小麥根際土樣,采用系列稀釋平板法將土壤懸浮液稀釋為10-1、10-2和10-3濃度,取10-3濃度的土壤懸浮液1mL于已加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,搖勻,置于培養(yǎng)箱中25℃恒溫培養(yǎng)3d后,挑取菌落特征與木霉相似的單個菌落,經(jīng)多次分離純化。分離培養(yǎng)基為改良的PCNB孟加拉紅PDA培養(yǎng)基。1.1.2分生孢子梗形態(tài)觀察將純化后的木霉菌株再接種到PDA培養(yǎng)基上,25℃恒溫培養(yǎng),肉眼觀察菌絲層薄厚,疏密,顏色變化,待菌落剛變綠時,挑取菌絲觀察分生孢子梗分枝模式及形態(tài)。按Rifai及Bissett修訂的木霉屬種群分類系統(tǒng),根據(jù)文成敬、唐嘉義、肖性龍等的描述和檢索表,對各個菌株進(jìn)行分類鑒定。1.2試驗植物的抗病性真菌按照劉清華的方法,從小麥紋枯病田采集病株經(jīng)分離純化獲得小麥紋枯病菌株;從患病番茄果實上分離純化獲得番茄灰霉病菌株。1.3木霉對小麥陰道感染和番茄灰霉病菌的抗性1.3.1生長速度的測定將分離鑒定后的木霉菌株和病原菌株分別接種在無菌的PDA平板上,3次重復(fù),40h后測定各菌株生長所形成菌落的線性生長速度。菌絲生長速度(cm/d)=平均菌落直徑/生長時間。1.3.2病原菌抑制率測定將分離鑒定后的木霉菌和供試病原菌菌種同時擴(kuò)大培養(yǎng)3d,使其生長勢基本一致。培養(yǎng)皿中加入10～15mL的PDA培養(yǎng)基制成平板,切取0.25cm2大小的木霉菌和植物病原菌菌絲塊,每培養(yǎng)皿中接一種木霉菌和病原菌,兩點相距4cm,每處理重復(fù)3次。同時以只接木霉菌和只接病原菌作對照,置25℃培養(yǎng)。逐日觀察記錄病原菌菌落的生長和木霉菌的抑菌作用,連續(xù)觀察7～10d。計算病原菌抑制率。抑制百分率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100。1.3.3木霉菌和植物病原菌的接種在無菌的PDA平板上,鋪上一張已滅菌的1cm×4cm的玻璃紙條,切取0.25cm2大小的已同時擴(kuò)大培養(yǎng)3d后的木霉菌和植物病原菌菌絲塊分別接在紙條兩端,25℃恒溫培養(yǎng),以只接木霉菌和只接病原菌作對照,重復(fù)3次。當(dāng)兩菌菌絲交接后,扯下玻璃紙條平放于載玻片,置顯微鏡下觀察兩菌絲間的相互作用。2結(jié)果與分析2.1集合種的篩選經(jīng)過顯微形態(tài)學(xué)鑒定,共得到3個木霉集合種:綠木霉(T.virens)、哈茨木霉(T.harzianum)和綠色木霉(T.viride)。2.2其他綠色木霉種,以受載線由表1可以看出,3種木霉菌中綠木霉的生長速度最快,綠色木霉次之,為它們迅速占領(lǐng)營養(yǎng)空間以及與病原菌競爭提供了天然優(yōu)勢。紋枯病的生長速度也較快,哈茨木霉和灰霉的生長速度較慢。2.3不同木霉菌對番茄灰霉病菌的生長抑制率對峙培養(yǎng)過程中,3種木霉菌和病原菌先在各自一側(cè)的PDA平板上生長,隨著培養(yǎng)時間延長,木霉菌開始包圍或覆蓋病菌菌落,與對照相比病原菌生長受到明顯抑制。尤其是哈茨木霉對灰霉菌的拮抗作用最為明顯(圖1),哈茨木霉沿灰霉菌落四周生長,形成包圍圈,灰霉病菌逐漸被壓縮抑制,木霉菌絲進(jìn)一步擴(kuò)展侵入病菌菌落,最終灰霉萎縮被哈茨木霉所覆蓋,并形成大量綠色孢子。對峙培養(yǎng)法測定結(jié)果(表2)表明,3種木霉菌對供試的2種病原菌都有一定的抑菌作用,但強(qiáng)度不同,而且3種木霉菌對番茄灰霉病菌的拮抗作用都比各自對小麥紋枯病菌的拮抗作用明顯,尤其哈茨木霉對番茄灰霉病菌的生長抑制率120h時為90.7%,對小麥紋枯病菌的生長抑制率僅為29.2%;而綠木霉對小麥紋枯病菌和番茄灰霉病都有較好的拮抗作用,綠木霉對小麥紋枯病菌的生長抑制率120h為64.5%,對番茄灰霉病菌的生長抑制率120h時為76.2%。從表2還可看出,對峙培養(yǎng)60h時綠木霉對番茄灰霉病菌的抑制率表現(xiàn)為最高達(dá)到53.6%,綠木霉的生長速度很快,能快速占據(jù)生存空間和爭奪養(yǎng)分,而番茄灰霉病菌生長速度較慢,從而受到明顯抑制。哈茨木霉對番茄灰霉病菌的生長抑制剛開始時并不明顯,是因為哈茨木霉的生長速度不快,但當(dāng)兩菌交接后表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用,120h時抑制率達(dá)到90.7%,因為木霉的拮抗作用除了空間競爭作用外,還有重寄生作用和溶菌作用。2.4木霉菌的生長從對峙培養(yǎng)界面處菌絲的顯微觀察結(jié)果可知(圖2～4):木霉菌對病原菌的拮抗作用主要分為3個階段。初期:木霉菌能夠識別并趨向病原菌生長;中期:木霉菌以其菌絲纏繞病菌的菌絲壁,或以附著胞附于病菌菌絲上,然后穿透菌絲在其內(nèi)生長,界面處病菌菌絲的細(xì)胞質(zhì)變稀薄、消解或菌絲斷裂;后期:病菌菌絲停止生長。3木霉菌的篩選3.1木霉的種類以及分布與各地的氣候、土壤,以及采樣季節(jié)都有密切的關(guān)系。文成敬等報道我國西南地區(qū),地形復(fù)雜氣候多變,自然資源豐富,特別適合木霉生存,所以木霉種類多,分布廣,哈茨木霉和擬康氏木霉為西南地區(qū)木霉優(yōu)勢種群。肖性龍等研究認(rèn)為哈茨木霉菌是濟(jì)南周邊地區(qū)木霉菌優(yōu)勢種。本實驗取樣時間在3月底4月初左右,取樣地點在淄博周邊地區(qū),因天氣較冷,不利于木霉生長,使得分離出的木霉種類較少,主要是哈茨木霉和綠木霉,表明淄博周邊地區(qū)的木霉菌優(yōu)勢種為哈茨木霉和綠木霉。3.2土壤中微生物種類多,如果不選擇合適的培養(yǎng)基則很難從土壤中分離出各種木霉。木霉對各種抗生素和農(nóng)藥具有一定的抗性作用,本實驗最初進(jìn)行分離木霉的培養(yǎng)基就含有氯霉素、敵可松和三唑酮,結(jié)果沒有長出木霉,分析原因可能是由于木霉種類偏少和加入三唑酮及敵可松的量過多造成的。為了能更好的篩選到綠木霉,選用了改良的PCNB孟加拉紅PDA培養(yǎng)基,這樣雖然有多種微生物長出,但保證了獲得木霉菌株,經(jīng)過反復(fù)分離、純化、鑒定等多個步驟,最終得到了分離純化的木霉菌株。3.3在本實驗中,木霉菌對營養(yǎng)和空間具有強(qiáng)烈的競爭能力,對病原菌的拮抗作用表現(xiàn)為對菌絲的纏繞、使病原菌菌絲細(xì)胞質(zhì)變稀薄、菌絲解體等現(xiàn)象。3種木霉菌對小麥紋枯病菌和番茄灰霉病都有一定程度的拮抗作用,但對番茄灰霉病菌的抑菌作用都比各自對小麥紋枯病菌的抑菌作用強(qiáng)。其中哈茨木霉對番茄灰霉病菌,綠