基于尼羅紅熒光探針的小球藻中油脂的測定

由于巖石燃料開采量的限制和碳氧化碳對世界氣候變化的影響，產生的生物源引起了廣泛的關注。其中，微藻具有快速生長、占用低土、高油含量等獨特優勢（三聚甘油可占30.70%）。尼羅紅(9-diethylamino-5-benzo[α]phenoxazinone)是一種脂溶性的熒光染料,能夠與活體細胞內的中性脂或其他脂類物質發生反應,而被用于微生物、細菌、酵母、浮游植物等細胞中脂類的定性和定量分析本文選擇從天然水體篩選出的產油綠藻—小球藻作為研究對象,采用酶標儀作為檢測儀器,研究了激發光波長、尼羅紅濃度、二甲基亞砜(DMSO)濃度、反應時間、反應溫度對微藻油脂測定的影響,分析了微藻油脂含量與尼紅羅相對熒光測定值之間的線性關系,為小球藻油脂含量的測定提供了一個簡便、快速的方法.1材料和方法1.1超純金屬試劑尼羅紅(NileRed,NR)購自美國MPBiomedicals公司.DMSO、丙酮購自美國Pharmco-Aaper公司.試劑采用Milli-Q制備的超純水(18MΩ·cm)進行配制.48孔酶標板(Costar354848)購自美國Costar公司.其他化學藥劑均為分析純試劑.1.2多功能酶標儀測定美國BioTekSynergyHT多功能酶標儀;SlMAmincoue5f83000UV/Vis紫外可見分光光度計;LabnetOrbit1.3海藻培養小球藻Chlorellavulgaris來自美國紐約州立大學生化實驗室所分離的藻種.培養基組成為(mg·L1.4酶標法測定酶首先向酶標板中加入800μL藻液,然后加入190μLDMSO(二甲基亞砜),于酶標板振蕩器上振蕩混合30s后,加入10μL50μg·mL酶標儀的測定條件為:激發光波長485nm,帶寬20nm,發射光波長580nm,帶寬50nm;激發光入射方向為酶標板上方,發射光檢測方向為酶標板上方,溫度40℃,以800μL超純水代替藻液的樣品作為NR的自發熒光背景值,作為參比樣品,設置為1000FU.1.5其他分析和測量取約2.5mL藻液置于比色皿中,于波長680nm處測定吸光度值,所測值為藻液光密度OD2結果與討論2.1激發光波長對系統反應的影響培養20d后的藻液光密度值OD尼羅紅作為脂類熒光探針,與細胞中中性油脂反應后,在激發光波長450—500nm,發射光波長大于528nm時,在熒光顯微鏡下可觀測到金黃色熒光,而極性脂與尼羅紅反應后,在激發光波長515—560nm,發射光波長大于590nm時,觀測到的是紅色熒光2.2dmso濃度和反應時間的影響DMSO作為一種促滲劑,能夠促進細胞壁對尼羅紅的滲透,從而提高尼羅紅與細胞內油脂的反應效率.當NR與藻液的反應時間為5min時,DMSO濃度對熒光值測定的影響如圖2所示.結果顯示,濃度為0—30%時,其產生的背景熒光值相差不大,在858—1349之間.但DMSO濃度對藻樣熒光的測定影響較大,當DMSO終濃度為20%時,藻液加入NR后的熒光值最大,達到6061,當DMSO濃度再增大時,熒光值反而下降,這是由于過高的DMSO濃度會對藻細胞產生一定的毒性,從而影響了熒光值的測定.當DMSO濃度為0時,其熒光值也較高,與25%DMSO的結果相近,顯示不加入DMSO也可以得到較好的測定結果,這與Chen等人的結果并不一致圖2還顯示,10%DMSO反應5min后的熒光值是所有結果中最低的,甚至低于不加入DMSO的熒光值.但是圖3顯示,隨著時間的延長,10%DMSO的熒光值在20min后出現了明顯的上升,80min后超過了25%、30%DMSO以及不加DMSO時的熒光值,這是由于DMSO濃度較低時,DMSO滲透較慢,導致熒光值隨時間而逐步上升.至于起始一段時間內熒光值較低的現象與其他結果并不一致2.3測定溫度的確定反應溫度對熒光值的測定影響可見圖4.結果顯示,當NR與藻液的反應溫度為40℃時,所測得的藻液熒光值最高,當溫度升高到45℃時,所測定的熒光值反而有所下降,表明高溫對藻細胞的活性帶來影響,而影響了熒光值的測定.其他的研究結果顯示,有的最佳測定溫度是在35—40℃2.4最終濃度為nr的影響NR終濃度對熒光值的影響見圖5.結果顯示,當NR濃度為0.50μg·mL2.5藻細胞油脂的熒光值隨時間的變化結果為了快速測定微藻產生的油脂含量,通常可以將采用重量法測定的油脂含量與尼羅紅熒光值之間建立一定的線性關系,通過測定尼羅紅熒光值而推算出藻細胞油脂的產量尼羅紅熒光強度與時間存在很大的關系,從圖6的結果可以看出,在加入NR后,藻液的熒光值稍有所提高后,出現了下降的趨勢.但是50—60min后,高濃度藻液的NR熒光值卻又出現了明顯的上升.在Elsey等人的研究中3小球藻油脂含量的測定(1)采用NR作為熒光探針,可以測定小球藻所產生的中性油脂含量,測定條件為:激發光波長485nm,發