擴張型心肌病的發病機制及治療

擴張性心肌病（tcm）是核電站心肌病，其主要特征是心臟收縮障礙和左心室擴張。發病率高，患者可能心力衰竭。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內源性單鏈小RNA并可通過調控靶基因表達進而調節基因轉錄后表達,研究顯示miRNA可調控T淋巴細胞發育及分化等過程1材料和方法材料表面共同語言患者的一般數據收集2015年3月至2016年4月本院收治的45例DCM患者為研究對象,作為DCM組,所有患者均符合WHO原發性擴張性心肌病診斷標準試劑和檢測試劑人T淋巴細胞白血病細胞JurkatT購自武漢華連科生物技術有限公司。RPMI1640培養基、胰酶購自杭州仟諾生科技有限公司;雙熒光報告檢測系統購自美國Promega公司;雙熒光報告檢測試劑盒購自北京白奧萊博科技有限公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;anti-CD3、anti-CD28、anti-CD4-FITC抗體、anti-CD25-PE抗體、anti-CD69-PE-Cy7抗體購自美國Biolegend公司;白細胞介素-2(IL-2)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購自美國BDBio-sciences公司;MTT檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司;Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司;miR-33bmimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)及其陰性對照購自上海吉瑪基因制藥技術有限公司;MycsiRNA及其陰性對照質粒購自廣州銳博生物科技有限公司;Trizol試劑與SYBRGreenqPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;M-MLVReverseTranscriptionKit試劑盒購自美國Invitrogen公司;兔抗人Myc多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自中山金橋生物技術有限公司;Westernblot所需試劑購自上海西寶生物科技股份有限公司;淋巴細胞分離液購自美國MPBiomedicals公司;紅細胞裂解液購自美國eBioscience公司。方法分離人外周血細胞,制備pbmcs細胞采用肝素鈉抗凝試管收集兩者受試者外周靜脈血5ml,2500r/min離心8min,收集上層血漿,加入等體積無菌PBS緩沖液,另取10ml無菌離心管,加入等體積淋巴細胞分離液,緩慢加入外周血,離心機中2500r/min離心20min,取出中間PBMCs層,加入4mlPBS緩沖液,混勻,1600r/min離心6min,棄上清并收集細胞,加入紅細胞裂解液(2ml),混勻,室溫靜置2min,加入PBS緩沖液至8ml,混勻后離心并收集細胞,采用RPMI1640培養基重懸細胞,調整細胞濃度2×10細胞培養和轉化用含有10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養基培養JurkatT細胞,置于37℃、5%COmrt-pcr檢測mir-33b和mycmna顯示CD4wormbft檢測納米蛋白取各組JurkatT細胞及CD4cd25和cd29表達水平收集各組對數生長期JurkatT細胞,用anti-CD3/28刺激JurkatT細胞24h,用anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE、anti-CD69-PE-Cy7抗體標記后,置于流式細胞儀檢測,采用FlowJo7.6軟件分析CD25和CD69平均熒光強度(MFI)。mtt顯示細胞克隆取各組對數生長期JurkatT細胞,0.25%胰酶消化,接種至96孔板,每孔細胞密度為5×10檢測t細胞激活功能分別將JurkatT細胞鋪于96孔U底板(2×10雙捕獲光素酶活性檢測收集呈指數式生長的JurkatT細胞,胰蛋白酶消化,制備細胞懸液,以每孔1×10統計分析采用統計學軟件SPSS21.0進行分析,一般正態計量資料采用2結果擴張性心肌病患者cd4通過qRT-PCR法檢測DCM患者CD4mir-33b在jurkatt細胞表達的表達分別將miR-33bmimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)轉染至JurkatT細胞,轉染48h后采用qRT-PCR法檢測JurkatT細胞中miR-33b表達,結果顯示miR-33b組JurkatT細胞中miR-33b表達水平顯著高于miR-con組,anti-miR-33b組JurkatT細胞中miR-33b表達水平顯著低于anti-miR-con組(mir-增加對jurkatt細胞增殖活性的影響MTT檢測JurkatT細胞增殖能力,結果顯示miR-33b組JurkatT細胞增殖活性顯著低于miR-con組,anti-miR-33b組JurkatT細胞增殖活性顯著高于anti-miR-con組(野生型wt-同體共轉染及熒光活性檢測靶基因預測軟件預測出miR-33b與Myc3′UTR存在結合位點,見圖5A。分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-33bmimic共轉染至JurkatT細胞,分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-con組共轉染至JurkatT細胞,檢測JurkatT細胞熒光活性,結果顯示野生型WT-Myc與miR-33bmimic共轉染JurkatT細胞熒光活性比WT-Myc與miR-con共轉染JurkatT細胞熒光活性顯著降低(si-con與jurkat細胞轉染后jurkatt細胞中mic蛋白表達水平的比較將MycsiRNA及其陰性對照質粒轉染至JurkatT細胞,轉染48h后采