實驗一人類外周血染色體標本制備一、實驗?zāi)康某醪秸莆杖祟惾旧w標本培養(yǎng)和制備的基本方法。二、實驗原理正常情況下，外周血中的小淋巴細胞，幾乎都處在G1期或G0期，外周血細胞中是沒有分裂相的。1960年發(fā)現(xiàn)外周血中的小淋巴細胞可以在植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)分裂刺激劑的影響下，在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣毎M行有絲分裂。這樣經(jīng)過短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可以迅速而又簡便地獲得體外生長的細胞群體和有絲分裂相。本方法已為臨床醫(yī)學、病毒學、藥理學、遺傳毒理學等方面廣泛應(yīng)用。

1三、實驗步驟

１、采血（已完成）２、培養(yǎng)（lymphocytescellculture）（已完成）RPMI1640培養(yǎng)液，37℃

0.5℃恒溫中培養(yǎng)72小時。3、秋水仙素(colchicine)處理在終止培養(yǎng)前２-３小時，加入秋水仙素。（已完成）

4、離心（centrifugalization）以1000rpm離心10分鐘，棄上清，留沉淀并用吸管打勻。

三、實驗步驟2５、低滲處理（hypotonictreatment）加８毫升預(yù)溫(37℃)的0.075MKCl低滲液（hypotonicsolution），用吸管打勻使細胞懸浮于低滲液中，37℃水浴箱靜止25－30分鐘。6、預(yù)固定（pre-fixation）低滲后，加新配的固定劑（甲醇︰冰醋酸=3︰1）１毫升，打勻。7、再離心1000rpm離心10分鐘，棄上清液，留沉淀。５、低滲處理（hypotonictreatment）6、預(yù)3８、固定(fixation)加入固定液（甲醇︰冰醋酸=3︰1）5ml，將沉淀打勻，固定20分鐘。

９、再離心1000rpm離心10分鐘，棄上清液，留沉淀。10、再固定：加入固定液（甲醇︰冰醋酸=1︰3），固定20分鐘。８、固定(fixation)411、再離心1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄去上清液，留沉淀。

12、再固定加入固定液（甲醇︰冰醋酸=1︰1）打勻，固定20分鐘。13、制片固定后，1000rpm離心10分鐘，留下0.2ml沉淀物，吸取細胞懸液滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即用嘴吹散，在灑精燈焰上通過幾次，使細胞平鋪于載玻片上，空氣干燥（dirdrying）。11、再離心514、染色（Giemsastaining）

Giemsa染液染色８分鐘，玻片用自來水沖洗，晾干。

15、鏡檢（microscopicexamination）14、染色（Giemsastaining）6一人類外周血染色體標本制備一ppt課件7四、試劑和藥品1、培養(yǎng)液的配制RPMI1640培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉)80％小牛血清(56℃水浴滅活30分鐘)20％植物血凝素PHA(主要成分是粘多糖和蛋白質(zhì))4％青霉素終濃度100單位/毫升鏈霉素終濃度100單位/毫升用3.5%NaHCO3調(diào)pH到7.0-7.2，玻璃濾器抽濾滅菌。在超凈工作臺，分裝到培養(yǎng)瓶中（每瓶含培養(yǎng)基5毫升）。培養(yǎng)基置于-20℃冰箱保存。使用前從冰箱中取出，溫育至37℃。四、試劑和藥品82、肝素（heparin）：濃度0.2％，200毫克肝素粉末溶于100毫升生理鹽水中。高壓滅菌，冰箱保存?zhèn)溆谩?、秋水仙素：10微克/毫升，作為有絲分裂的阻止劑，抑制細胞分裂時紡錘體形成，使細胞分裂停止在中期。稱10毫克秋水仙素溶于100毫升生理鹽水中，配成100微克/毫升的原液，分裝小瓶，高壓滅菌，-20℃冰箱保存。臨用時取上述原液用生理鹽水稀釋成10微克/毫升。4、0.075MKCl：0.559克氯化鉀溶于100毫升雙蒸水中。5、甲醇（methanol）二者以不同比例配合使用6、冰醋酸（aceticglacid）新鮮配制2、肝素（heparin）：濃度0.2％，29７、吉姆沙染液（Giemsa）

吉姆沙由天青、伊紅和甲基藍組成先將0.5克吉姆沙粉未干研磨，加33毫升60℃預(yù)熱的純甘油，在研缽中研磨，在60℃水浴中保溫90分鐘。冷卻后，再加入33毫升甲醇，濾紙過濾，收集在棕色瓶中保存。原液要提前半年配制。原液中按比例加入磷酸緩沖液即可染染色體標本。

1份Giemsa原液＋9份磷酸緩沖液

８、磷酸緩沖液(pH6.8)溶液A：磷酸二氫鉀(KH2PO4.2H2O)9.078克溶于1000毫升蒸餾水中。溶液B：磷酸氫二鈉(Na2HPO4.2H2O)11.876克溶于1000毫升蒸餾水中。100毫升緩沖液：需溶液Ａ50.8毫升，溶液Ｂ49.2毫升。７、吉姆沙染液（Giemsa）10五、注意事項1、采血接種培養(yǎng)時，注意加入適量的肝素。2、培養(yǎng)基中不含L-谷氨酰胺，則溶解有RPMI1640培養(yǎng)基的液體可先用濃鹽酸調(diào)pH值等于4，然后高壓滅菌（注意121℃，15磅，滅菌15分鐘）。冷卻后，再加入L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、PHA、滅活小牛血清和雙抗。3、接種的血樣愈新鮮愈好，最好在24小時內(nèi)培養(yǎng)。如果不能立刻培養(yǎng)，應(yīng)置于4℃冰箱，保存時間過久會影響細胞活力。五、注意事項114、溫度和培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。人的外周血中淋巴細胞培養(yǎng)最適溫度為37℃

0.5℃，溫度過高過低都將影響細胞的生長，但細胞對低溫比對高溫耐受力強；若是中途停電，可相應(yīng)延長培養(yǎng)時間。培養(yǎng)液的最適pH7.2-7.4。pH偏酸，細胞發(fā)育不良，偏堿細胞會出現(xiàn)輕度固縮。5、PHA的質(zhì)量和濃度是培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵問題。PHA如果保存時間太長，效價會降低，應(yīng)在培養(yǎng)基中多加一些。6、培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集可輕輕震蕩，使凝集塊散開，繼續(xù)培養(yǎng)。7、最好使用水平式離心機，離心速度不易過高，否則沉降在管底的細胞團不易打散；反之，離心速度太低，細胞會丟失。4、溫度和培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。人的外周血128、培養(yǎng)失敗的可能原因：

培養(yǎng)瓶等器材洗滌不合要求。

配制培養(yǎng)基溶液的二或三蒸水不合要求。