一、基因工程的基本操作程序eq\a\vs4\al(閱讀教材P8)目的基因的獲取→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定。二、目的基因的獲取eq\a\vs4\al(閱讀教材P8～11)1．目的基因主要是編碼蛋白質的結構基因，也可以是一些具有調控作用的因子。2．獲取目的基因的依據基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色體上的位置，基因的轉錄產物mRNA，基因的表達產物蛋白質。3．目的基因的獲取方法(1)從基因文庫中獲取目的基因①基因文庫含義：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。②基因文庫種類eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(基因組文庫：含有一種生物的所有基因,部分基因文庫：含有一種生物的部分基因，,如cDNA文庫))(2)利用PCR技術擴增目的基因①PCR技術全稱是多聚酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。②原理：DNA雙鏈復制。③擴增過程變性：目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈↓復性：引物與單鏈相應互補序列結合↓延伸：在DNA聚合酶作用下延伸子鏈(3)人工合成法：適于合成基因較小，且核苷酸序列已知的目的基因。三、基因表達載體的構建——基因工程的核心eq\a\vs4\al(閱讀教材P11)1．基因表達載體的組成(1)目的基因。(2)啟動子eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(位置：基因的首端,功能：是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動,基因轉錄出mRNA))(3)終止子eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(位置：基因的尾端,功能：終止轉錄))(4)標記基因：鑒別受體細胞中是否含有目的基因。(1)使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。(2)使目的基因能夠表達和發揮作用。四、將目的基因導入受體細胞eq\a\vs4\al(閱讀教材P11～13)1．轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。2．導入不同類型生物細胞的方法(1)導入植物細胞①方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(農桿菌轉化法：適用于雙子葉植物和裸子植物,基因槍法：適用于單子葉植物,花粉管通道法))②受體細胞：植物體細胞。(2)導入動物細胞eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(①方法：顯微注射技術,②常用受體細胞：受精卵))(3)導入微生物細胞①方法：用Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態(這種細胞稱為感受態細胞)。②受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌細胞)。③原核生物的特點：繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少等。五、目的基因的檢測與鑒定eq\a\vs4\al(閱讀教材P13～15)1．分子水平上的檢測與鑒定(1)DNA分子雜交技術eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(①檢測轉基因生物染色體上的目的基因,②檢測目的基因是否轉錄出mRNA))(2)抗原—抗體雜交技術：用于檢測目的基因是否翻譯出蛋白質。2．個體生物學水平上的檢測與鑒定如一個抗蟲或抗病的目的基因導入植物細胞后，是否賦予了植物抗蟲或抗病特性，需要做抗蟲或抗病的接種實驗。

[共研探究]1．目的基因的獲取獲取目的基因是實施基因工程的第一步，隨著科學技術的發展，目前獲取目的基因的常用方法有以下幾種。閱讀教材相關內容，結合提供的資料，完成下面的思考。(1)目的基因主要是指編碼蛋白質的基因。(2)目的基因的獲取方法有從基因文庫中獲取、PCR技術擴增和人工合成三種。①直接分離：從自然界中已有的物種中分離，如從基因文庫中獲取。a．基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因。b．基因文庫種類文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子(具有啟動作用的DNA片段)無有基因中內含子(位于編碼蛋白質序列內的非編碼DNA片段)無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因文庫類型cDNA文庫基因組文庫物種間的基因交流可以部分基因可以c.基因組文庫含有一種生物的全部基因，而cDNA文庫只含有一種生物的部分基因，二者都是基因文庫。②人工合成法：如果基因較小，核苷酸序列又已知，可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。人工合成包括利用DNA進行化學合成和反轉錄法。③利用PCR技術擴增目的基因的條件、過程a．原理：DNA復制。b．前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。c．條件：DNA模板、引物、熱穩定DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸。d．過程：2．DNA復制與PCR技術的比較DNA復制PCR技術區別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋場所細胞內細胞外酶解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)溫度條件細胞內溫和條件需控制溫度，在較高溫度下進行合成的對象DNA分子DNA片段或基因[總結升華]獲取目的基因方法的比較方法基因文庫的構建PCR技術擴增人工合成過程供體細胞中的DNA↓限制酶許多DNA片段↓連接表達載體↓導入受體細胞↓外源DNA擴增，產生特定性狀↓分離目的基因目的基因的mRNA↓反轉錄單鏈DNA↓合成雙鏈DNA↓插入載體↓導入受體菌群(cDNA文庫)↓分離目的基因蛋白質的氨基酸序列↓推測mRNA的核苷酸序列↓推測基因的核苷酸序列↓化學合成目的基因優點操作簡單專一性強可在短時間內大量擴增目的基因專一性強，可產生自然界中不存在的新基因缺點工作量大、盲目性大、專一性差操作過程較麻煩，技術要求過高需要嚴格控制溫度、技術要求高適用范圍小聯系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸[對點演練]1．下列不屬于獲取目的基因的方法是()A．利用DNA連接酶復制目的基因B．反轉錄法C．從基因文庫中獲取目的基因D．利用PCR技術擴增目的基因解析：選A對目的基因(DNA片段)進行復制需利用DNA聚合酶而不是DNA連接酶。[共研探究]1．基因表達載體的構建基因表達載體的構建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。依圖填空，并回答有關問題。(1)構建基因表達載體的目的①使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。②使目的基因能夠表達和發揮作用。(2)構建基因表達載體的過程：目的基因與載體結合的過程，實質上是不同來源的DNA重新組合的過程。其過程如下：(3)啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子相同嗎？提示：不相同，啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達必需的部分。起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結束。(4)基因表達載體的構建需要限制酶、DNA連接酶。【歸納拓展】真核細胞基因結構(1)結構：①編碼區：內含子、外顯子；②非編碼區：啟動子、終止子。基因結構如圖所示：(2)表達：只有編碼區能轉錄生成RNA，且內含子轉錄的部分要剪切掉，即轉錄生成的mRNA只有外顯子的對應部分。因此，以mRNA為模板，反轉錄產生的目的基因中沒有內含子、啟動子和終止子。2．將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞是實施基因工程的第三步。目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程，稱為轉化。結合圖1、圖2、圖3，根據教材相關內容完成下列思考。(1)結合圖示理解農桿菌轉化法的過程(2)將目的基因導入受體細胞的方法生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法顯微注射技術Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程將目的基因插入Ti質粒的T－DNA上→農桿菌→導入植物細胞→融合到受體細胞的DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態細胞→重組表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子(3)為什么植物的體細胞可以作為受體細胞，而動物的體細胞不能作為受體細胞？提示：植物體細胞的全能性較高，可經植物組織培養過程成為完整植物體；動物體細胞全能性受到限制，不能發育為一個新個體，因此動物基因工程中的受體細胞一般是受精卵。(4)從細胞器的功能上分析，若通過基因工程生產人的糖蛋白，可以用大腸桿菌作受體細胞嗎？提示：不可以。因為糖蛋白上的糖鏈是在內質網和高爾基體上加工完成的，而內質網和高爾基體存在于真核細胞中，大腸桿菌是原核生物，細胞中不含有這兩種細胞器。[總結升華]【易錯易混】(1)構建基因表達載體①用同一種限制酶切割質粒和目的基因，以獲得互補的黏性末端，利于重組質粒的構建。②插入的目的基因只是結構基因部分，其表達需要調控序列，因而用作載體的質粒的插入部位前須有啟動子，后須有終止子。③終止子是DNA分子上決定轉錄停止的DNA序列；終止密碼子是指mRNA分子上決定翻譯停止的三個相鄰堿基。(2)農桿菌轉化法中有兩次拼接和兩次導入。第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒上T－DNA的中間部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導入是將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA進入受體細胞。[對點演練]2．如圖為基因表達載體的模式圖，下列有關基因工程中載體的說法，錯誤的是()A．基因工程的核心步驟是基因表達載體構建B．任何基因表達載體的構建都是一樣的，沒有差別C．圖中啟動子位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作為標記基因，用于鑒別受體細胞中是否導入了目的基因解析：選B由于受體細胞有植物、動物和微生物，所以目的基因導入受體細胞的方式不同，因此，基因表達載體的構建也會有所差別，不可能是千篇一律的。3．科學家通過基因工程的方法，將蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因轉入普通棉株細胞內，并成功實現了表達，從而培育出了能抗棉鈴蟲的棉花植株——抗蟲棉。其過程大致如圖所示，請分析回答：(1)Ti質粒是農桿菌中的一種質粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti質粒的T－DNA中是利用T－DNA____________的特點。(2)Bt毒蛋白基因轉入普通棉株細胞內并成功實現表達的過程，在基因工程中稱為________。(3)將目的基因導入受體細胞的方法有很多種，該題中涉及的是________________。解析：(1)Ti質粒的最大優點是能將目的基因導入受體細胞的染色體DNA中，從而使目的基因在棉花體內穩定維持和表達。(2)目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程稱為轉化。(3)將目的基因導入植物細胞方法很多，以農桿菌中的Ti質粒為目的基因載體的稱為農桿菌轉化法。答案：(1)可轉移至受體細胞并且融合到受體細胞染色體DNA上(2)轉化(3)農桿菌轉化法[共研探究]目的基因導入受體細胞后，是否可以穩定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。這是基因工程的第四步工作，也是檢查基因工程是否做成功的一步。結合下述材料，完成探究。1．目的基因的檢測(分子水平檢測)(1)從圖中分析可得檢測目的基因的方法為DNA分子雜交技術，其原理是采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區；若沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。(2)分子檢測的方法①DNA和DNA分子之間的雜交。目的基因是否融合到受體生物的染色體DNA中，這是真核生物中的目的基因可否穩定存在和遺傳的關鍵。要驗證這一點，就需要通過DNA和DNA分子間的雜交技術。主要做法是用放射性同位素標記目的基因DNA片段作探針，以此檢測受體細胞的DNA中有無目的基因。②DNA和RNA分子之間的雜交。它是檢測目的基因是否轉錄出mRNA的方法，具體做法是從轉基因生物中提取mRNA，用標記的目的基因作探針，與mRNA雜交，如果顯示出雜交帶，則表明目的基因轉錄出了mRNA，意味著目的基因開始發揮功能。③蛋白質分子(抗原—抗體)之間的雜交。具體做法是：用相應的抗體進行抗原—抗體雜交，若有雜交帶出現，表明目的基因已經表達出了蛋白質。2．鑒定(個體生物學水平鑒定)觀察圖示，判斷抗蟲棉的接種實驗屬于個體生物學水平鑒定，通過做抗蟲(或抗病)的接種實驗以確定是否具有抗性及抗性的程度。還可對基因工程產品與天然產品的功能進行活性比較，以確定轉基因產品的功能活性是否與天然產品相同。3．應用(1)檢測棉花中導入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是什么？提示：用葉片飼養棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。如果棉鈴蟲死亡，說明抗蟲基因已經表達；否則，目的基因沒有表達。(2)DNA分子雜交的原理是堿基互補配對原則。DNA分子雜交可用于親子鑒定、刑事偵查、生物親緣關系鑒定等。[總結升華]1．目的基因的檢測與鑒定2．不同分子檢測的原理、場所、探針的異同(1)原理：進行轉錄水平的檢測原理與復制水平的檢測原理是相似的，只是被檢測的物質不再是轉基因生物的基因組DNA，而是轉基因生物細胞內的mRNA；進行翻譯水平的檢測，則是利用抗原與抗體特異性結合的原理。(2)場所：不論是復制水平、轉錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在體外進行的。(3)探針：在DNA分子、mRNA分子水平上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉錄時，用的探針都是放射性同位素等標記的含有目的基因的DNA片段。【易錯易混】基因工程的幾個易錯點(1)在基因工程的四個操作步驟中，只有第三步將目的基因導入受體細胞不涉及堿基互補配對，其余三個步驟都涉及堿基互補配對。(2)原核生物繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少，有利于目的基因的復制與表達，因此常采用大腸桿菌等原核生物作為受體細胞。[對點演練]4．目的基因導入受體細胞后，是否可以穩定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是()①檢測受體細胞是否有目的基因②檢測受體細胞是否有致病基因③檢測目的基因是否轉錄出mRNA④檢測目的基因是否翻譯成蛋白質A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④解析：選C目的基因的檢測包括：檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探針與基因組DNA雜交；檢測目的基因是否轉錄出mRNA，方法是用基因探針與mRNA雜交；檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是進行抗原—抗體雜交。1．下列關于基因文庫的說法，錯誤的是()A．可分為基因組文庫和部分基因文庫B．cDNA文庫屬于部分基因文庫C．基因組文庫的基因在不同物種之間均可進行基因交流D．同種生物的cDNA文庫基因數量較基因組文庫基因數量少解析：選C基因組文庫只有部分基因能夠在不同物種之間進行交流。2．基因表達載體的必需組成部分是()①啟動子②終止密碼子③標記基因④目的基因⑤終止子A．①②③④B．①③④⑤C．①②④⑤D．①②③⑤解析：選B啟動子位于基因表達載體的首端，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質；終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉錄在所需要的地方停止下來；標記基因是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來；目的基因是基因表達載體上必須具有的結構。3．下列關于目的基因檢測與鑒定的敘述，錯誤的是()A．可以根據受體細胞是否具有某種抗性來判斷受體細胞是否獲得了目的基因B．受體細胞必須表現出目的基因控制的特定性狀，才能說明目的基因完成了表達過程C．目的基因檢測的第一步是檢測目的基因是否插入到轉基因生物的染色體DNA上D．檢測到受體細胞含有目的基因就標志著基因工程操作成功解析：選D目的基因成功導入受體細胞只是基因工程操作成功的必要一步，標志著基因工程操作成功的是目的基因在受體細胞中成功表達。4．如圖表示基因工程的主要操作步驟，請據圖回答問題。(1)①過程是________，需要________酶參與；②過程是____________，需要________酶參與。(2)③過程中使用Ca2＋處理受體細胞可以增大________________，使重組質粒進入受體細胞。(3)重組DNA分子進入受體細胞后，受體細胞必須________________，才能說明目的基因完成了表達過程。(4)不同生物的基因能夠進行重組，原因是________________________________________________________________________________________________。解析：分析圖示可知：①過程是獲取目的基因，該過程需要的酶是限制酶；②過程是構建基因表達載體的過程，該過程需要用到DNA連接酶。若受體細胞是微生物細胞，將重組質粒導入時，首先應用Ca2＋處理受體細胞，可以增大細胞膜的通透性，使重組質粒易于進入受體細胞。目的基因完成表達的標志是受體細胞內合成了相應的蛋白質。不同生物之間能夠進行轉基因，其原因應從基因的化學組成和空間結構兩方面考慮。答案：(1)獲取目的基因限制構建基因表達載體DNA連接(2)細胞膜的通透性(3)表達出目的基因產物(4)不同生物的DNA具有相同的化學組成和空間結構【基礎題組】1．下列有關目的基因獲取的理解，不正確的是()A．目的基因可以從自然界中分離，也可以人工合成B．目的基因主要指編碼蛋白質的結構基因C．基因文庫就是基因組文庫D．cDNA文庫只含有某種生物的一部分基因解析：選C基因文庫又分為基因組文庫和部分基因文庫。cDNA文庫是部分基因文庫。2．下列關于基因表達載體構建的相關敘述，不正確的是()A．需要限制酶和DNA連接酶B．必須在細胞內進行C．抗生素抗性基因可作為標記基因D．啟動子位于目的基因的首端解析：選B基因表達載體的構建是指目的基因與載體結合，在此過程中需用同一種限制酶切割目的基因與載體，用DNA連接酶將互補的末端連接起來；基因表達載體的構建是在細胞外進行的；基因表達載體包括啟動子(位于基因首端使轉錄開始)、終止子、目的基因和標記基因。3．利用蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因培育的抗蟲棉是否成功，最好檢測()A．是否有抗生素產生B．是否有目的基因表達C．是否有抗蟲的性狀出現D．是否能分離到目的基因解析：選C要檢驗導入了抗蟲基因的棉花植株是否抗蟲，需要做抗蟲的接種實驗，以確定棉花是否有抗蟲的性狀出現，如果有抗蟲的性狀出現，則說明抗蟲棉培育成功。4．在基因工程技術中，需要用Ca2＋處理的環節是()A．目的基因的提取和導入B．目的基因與載體結合C．將目的基因導入受體細胞D．目的基因的檢測與鑒定解析：選C如果載體是質粒，受體細胞是細菌，一般是將細菌用Ca2＋處理，以增大細菌細胞膜的通透性，使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。5．將目的基因導入玉米莖尖分生區細胞和小鼠受精卵，常采用的方法分別是()A．顯微注射法、農桿菌轉化法B．基因槍法、花粉管通道法C．農桿菌轉化法、顯微注射法D．基因槍法、顯微注射法解析：選D玉米是單子葉植物，常用的轉化方法是基因槍法；對于動物細胞，常用的轉化方法是顯微注射法。6．下列關于cDNA文庫和基因組文庫的說法，不正確的是()A．cDNA文庫中的DNA來源于mRNA的反轉錄B．如果某種生物的cDNA文庫中的某個基因與該生物的基因組文庫中的某個基因控制的性狀相同，則這兩個基因的結構也完全相同C．cDNA文庫中的基因都沒有啟動子D．一種生物的cDNA文庫可以有許多種，但基因組文庫只有一種解析：選B由于基因轉錄時只有編碼區段才能轉錄，所以以mRNA反轉錄成的DNA就只有外顯子區段，而缺少內含子和啟動子等非編碼區段，和原來的基因結構不相同。7．利用外源基因在受體細胞中表達，可生產人類所需要的產品。下列能說明目的基因完成了在受體細胞中表達的是()A．棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因B．大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNAC．山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列D．酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白解析：選D目的基因的表達是指在受體細胞中產生了目的基因所控制合成的蛋白質。在受體細胞中檢測到目的基因或其轉錄產物RNA，并不能表明目的基因已經成功表達。8．下列關于基因表達載體導入微生物細胞的敘述，不正確的是()A．常用原核生物作為受體細胞，是因為原核生物繁殖快，且多為單細胞，遺傳物質相對較少B．受體細胞所處的一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態稱為感受態C．感受態細胞吸收DNA分子需要適宜的溫度和酸堿度D．感受態細胞吸收重組表達載體DNA分子的液體只要調節為適宜的pH即可，沒必要用緩沖液解析：選D將基因表達載體導入微生物細胞時，需在一定條件(如適宜的溫度、pH等)下，將基因表達載體和感受態的微生物細胞混合培養，在培養過程中，可能會影響pH的變化，因此要加入緩沖液，以保持適宜的pH。【能力題組】9．(2014·重慶高考)如圖為利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，正確的是()A．②的構建需要限制性核酸內切酶和DNA聚合酶參與B．③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④的染色體上C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現出抗蟲性狀D．⑤只要表現出抗蟲性狀就表明植株發生了可遺傳變異解析：選D構建重組質粒需要限制性核酸內切酶和DNA連接酶，不需要DNA聚合酶。含重組Ti質粒的農桿菌侵染植物細胞后，重組Ti質粒的T－DNA整合到受體細胞的染色體上，而不是重組Ti質粒整合到受體細胞的染色體上。導入受體細胞的目的基因表達后，轉基因植株方能表現出相應性狀，若目的基因在受體細胞中不表達，轉基因植株不能表現出相應性狀。⑤表現出抗蟲性狀則表明該植株細胞發生了基因重組，基因重組是可遺傳變異。10．天然的玫瑰沒有藍色花，這是由于缺少控制藍色色素合成的基因B，而開藍色花的矮牽牛中存在序列已知的基因B，現用基因工程技術培育藍玫瑰，下列操作正確的是()A．提取矮牽牛藍色花的mRNA，經過反轉錄獲得互補的DNA，再擴增基因BB．利用限制酶從開藍色花牽牛的基因文庫中獲取基因BC．利用DNA聚合酶將基因B與質粒連接后導入玫瑰細胞D．將基因B直接導入大腸桿菌，然后感染并轉入玫瑰細胞解析：選A由題意知：控制藍色色素合成的基因B是目的基因，提取矮牽牛藍色花的mRNA，經反轉錄獲得互補的DNA，再擴增基因B，構建表達載體，然后導入天然玫瑰的細胞中，培育該受體細胞即能獲得藍玫瑰。從基因文庫中獲取目的基因，直接用引物擴增即可。將目的基因B與質粒連接需用DNA連接酶，而不是DNA聚合酶。基因B需與質粒連接形成基因表達載體再導入農桿菌，然后感染并轉入玫瑰細胞，而不能將基因B直接導入大腸桿菌。11.質粒是基因工程中最常用的載體，它存在于許多細菌體內，某細菌質粒上的標記基因如圖所示，通過標記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉移成功。外源基因插入的位置不同，細菌在培養基上的生長情況也不同，如圖所示外源基因在質粒中可插入的位置有a、b、c點。某同學根據實驗現象對其插入的位點進行分析，其中分析正確的是()實驗現象實驗推論在含青霉素培養基上的生長情況在含四環素培養基上的生長情況目的基因插入的位置A能生長能生長aB不能生長能生長bC能生長不能生長cD不能生長不能生長c解析：選B若質粒上插入的位置在b點，那么抗四環素基因沒有被破壞，抗青霉素基因被破壞，導入該重組質粒的細菌在含青霉素的培養基上不能生長，在含四環素的培養基上能生長。12．某研究所的研究人員將生長激素基因通過質粒導入大腸桿菌細胞，使其表達，產生生長激素。已知質粒中存在兩個抗性基因：A是抗鏈霉素基因，B是抗氨芐青霉素基因，且目的基因要插入到基因B中，而大腸桿菌不帶有任何抗性基因。下列敘述正確的是()A．導入大腸桿菌的質粒一定為重組質粒B．RNA聚合酶是構建該重組質粒必需的工具酶C．可用含氨芐青霉素的培養基檢測大腸桿菌中是否導入了重組質粒D．在含氨芐青霉素的培養基中不能生長，但在含鏈霉素培養基中能生長的可能是符合生產要求的大腸桿菌解析：選D基因操作過程中，用同一種限制酶分別切割生長激素基因所在的DNA分子和質粒后，會產生相同的黏性末端，黏性末端連接時，目的基因和目的基因、目的基因和質粒、質粒和質粒都可能連接，因此，導入大腸桿菌的質粒不一定為重組質粒。構建該重組質粒必需的工具酶是限制酶和DNA連接酶。目的基因插入基因B中后形成的重組質粒的抗氨芐青霉素基因被破壞，故導入了重組質粒的大腸桿菌對氨芐青霉素不具有抗性，對鏈霉素仍具有抗性。13．如圖是利用基因工程方法培育抗蟲棉的過程。請回答相關問題：eq\x(Ti質粒)eq\x(抗蟲基因)eq\o(→,\s\up7(A))eq\x(\a\al(重組,質粒))eq\o(→,\s\up7(B))土壤農桿菌eq\o(→,\s\up7(C))eq\x(\a\al(含重組質粒的,土壤農桿菌))eq\o(→,\s\up7(D),\s\do5())eq\x(抗蟲棉)eq\o(→,\s\up7(E))eq\x(棉花細胞)(1)從蘇云金芽孢桿菌的DNA上獲取抗蟲基因，需要用到的工具是________，此工具主要是從________生物中分離純化出來的，它能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個脫氧核苷酸之間的________鍵斷開。(2)構建重組質粒時，常用Ti質粒作為載體，是因為Ti質粒上具有________，它能把目的基因整合到受體細胞的________上。(3)E過程是利用植物組織培養技術完成的，要確定抗蟲基因導入棉花細胞后，是否賦予了棉花抗蟲特性，在個體水平上還需要做________實驗。(4)將目的基因導入植物細胞，除采用圖示中的方法外，還可以采用________法和花粉管通道法。解析：(1)限制酶用于切割DNA分子，獲取目的基因。限制酶主要從原核生物細胞中獲取。限制酶可使磷酸二酯鍵斷裂，將DNA分子切開。(2)Ti質粒是可轉移DNA，其上的T－DNA可以整合到植物細胞的染色體DNA上，故將目的基因借助Ti質粒導入植物細胞中。(3)把害蟲接種到轉基因植株上，以檢測轉基因植株的抗蟲基因是否正常表達。答案：(1)限制酶原核磷酸二酯(2)T－DNA染色體DNA(3)抗蟲的接種(4)基因槍14．(2015·四川高考)將蘇云金桿菌Bt蛋白的基因導入棉花細胞中，可獲得抗棉鈴蟲的轉基因棉，其過程如圖所示(注：農桿菌中Ti質粒上只有T－DNA片段能轉移到植物細胞中)。(1)過程①需用同種________酶對含Bt基因的DNA和Ti質粒進行酶切。為將過程②獲得的含重組質粒的農桿菌篩選出來，應使用________培養基。(2)過程③中將棉花細胞與農桿菌混合后共同培養，旨在讓________進入棉花細胞；除盡農桿菌后，還須轉接到含卡那霉素的培養基上繼續培養，目的是__________________________________。(3)若過程④僅獲得大量的根，則應在培養基中增加______________以獲得芽；部分接種在無激素培養基上的芽也能長根，原因是________________________________________________________________________。(4)檢驗轉基因棉的抗蟲性狀，常用方法是________。種植轉基因抗蟲棉能減少________的使用，以減輕環境污染。解析：(1)切割目的基因和載體應使用同種限制性核酸內切酶，篩選細菌應使用選擇培養基。(2)農桿菌轉化法的原理是農桿菌感染植物時，Ti質粒上的T－DNA片段能夠轉移并整合到植物細胞的染色體DNA上。因為T－DNA上具有卡那霉素抗性基因，所以可用含卡那霉素的培養基篩選出獲得T－DNA片段的植物細胞。(3)植物組織培養過程中，可加入激素調節植物細胞的脫分化和再分