丁基苯酞對雙孔鉀離子通道TRE用及在低灌注腦缺血中相關藥理學研究雙孔鉀離子通道(Tandem-Pore-Domainnels,年發現的一類新型鉀離子通道超家族。它們在結構上與傳統的鉀離子通道不具有獨特的4次跨膜片段(M兩個孔道結構域(1P2)4TMP目前發現的雙孔鉀通道共包括1個成員根據結構和調節方式的不同可分為TWIKHIKASKALKR和TRESK類。TRE是雙孔鉀離子通道中研究最為廣泛的一類離子通道。該鉀通道電流具有自發性無電壓和時間依賴性無失活并且對于經典的鉀通道阻斷劑如4-APCs+)感等特性。既往研究發現,TR中樞神經系統的神經元上具有特異性的分布。它既可以被許多種物理和化學因素調還可以被多種神經保護劑所調,在腦缺血癲癇疼痛和抑郁等多種疾病狀態中發揮著重要的作用丁基苯酞或丁苯酞,3-n-butylph院所開發的一類新型神經保護藥物可以通過作用于腦損傷病理生理過程中的多個靶點而發揮腦保護作用。本研究組以往研究也已表明TRE鉀通道在急性和慢性腦缺血中都發揮著重要作用。然而抗腦缺血藥物丁基苯酞是否能夠調節TRE鉀通道,雙孔鉀通道TRE是丁基苯酞抗腦缺血中一個新的作用靶點目前都還未見報道。本研究中我們首先研究了丁基苯酞三種旋光異構體對TRE鉀離子通道電流的調節作用并探討了相關機制然后建立了急性大鼠低灌注腦缺血損傷模型研究左旋丁基苯酞對TRE鉀通道基因和蛋白表達變化的影響第一部分丁基苯酞旋光異構體對TRE鉀通道電流的調節作用及相關機制研究1.基苯酞旋光異構體對TRE鉀通道電流的調節作用首先觀察TREK-1雙孔鉀通道的基本特性并驗證花生四烯酸(A對TRE的開放作用。結果表明：野生型CHO胞(CH電位為-1mV(),轉染了TRE通道(TREK-1可C細O的膜電位超極化到-2.36mV(n=25,P下,C上記錄到的外向鉀電流為pA水平而穩定轉染TRE胞上外向鉀電流可達0.5-。nA應用10M可使TRE電流增大約50-70們發現丁基苯酞左旋右旋和消旋體三種旋光異構體可以濃度依賴性的抑制C胞轉染的TRE雙孔鉀通道右旋(d-丁苯酞(dL-抑BTRE電流的IC分別是μ和1μM,旋丁基苯酞(L-E電流的抑制作用明顯強于右旋和消旋體,IC是.4。丁基苯酞旋光異構體對TRE鉀通道的電壓依賴性沒有影響。電流鉗下丁基苯酞旋光異構體可使TREK-位向去極化移動而對CO胞膜電位無影響。2.旋丁基苯酞對TRE電流的調節機制研究首先觀察1μML-NBP對花生四烯酸激活的TRE的抑制作用；其次研究溫度和丁基苯酞對TRE流和細胞膜電位的協同作用最后應用細胞內微透析方法觀察10ML-BPRE電流調竹作用。結果表明：10M夠穩定激活轉染于CHO細胞上的TRE道加入濃度131μML-NBPRE電流分別減小1528.5%,液沖洗后電流部分恢復。采用細胞內微透析術全細胞記錄模式下觀察2m,TR度減小5當細胞周圍的溫度從23高到33,TR度顯著增加達到300%-加入1μML電流抑制6右。當溫度升高到33,CTREK-位都向超極化移動,絕對值升高分別為9和15給V1μML-NBPREK-1/CHO向去極化移動下降約10而胞膜電位沒有發生明顯變化。第二部分：左旋丁苯酞對大鼠低灌注腦缺血模型中雙孔鉀離子通道基因和蛋白表達的影響1.鼠低灌注腦缺血組織病理學改變大鼠低灌注腦缺血大腦皮層海馬和紋狀體H和Nis結果顯示假手術組和假手術組左旋丁苯酞藥物對照組細胞數量較多排列整齊規則單個神經細胞核呈圓核膜清楚核仁明顯并且兩組相比較形態學沒有差別；模型組和30mg/k治細胞出現明顯的減少或消失排列紊亂胞漿呈深染。核膜不清尼氏小體逐漸分解甚至消出現空泡及增生的膠質細胞少數細胞發生核溶核消失。但是30n組與模型組相比較神經細胞數量增多組織形態學有一定改善。2.鼠皮層、海馬和紋狀體組織中雙孔鉀通道亞型TREK-1mRNA水平的改變應用實時定量P法研究大鼠低灌注腦缺血天后,L-鼠皮層、海馬和紋狀體三個組織中TREK-表影響。與假手術組相比腦缺血后三個組織中TREK-表同程度的顯著升高,P<差異；假手術組左旋丁苯酞藥物組和假手術組相比較,TREK-1達沒有明顯變化；3mg/kgNBP后與模型組相比,皮層和海馬組織TREK-表現不同程度的下降趨勢而紋狀體組織TREmR達水平顯著下降,P<性差異。3大鼠皮層、海馬型TRE水平的改變蛋白免疫印跡雜交(Wester的方法研究了大鼠低灌注腦缺血模型中L-NBTRE通道在。Wester析顯示腦缺血后皮層、海馬和紋狀體組織,TREK-1達都有不同程度的顯著升高,P<差異。左旋丁苯酞藥物對照組,TR達沒有變化。30mg/k治療后組相比皮層和海馬組織中TRE表達都有不同程度的下降而紋狀體內TRE出現顯著下降,P<05著性差異。從以上結果可以得到以下結論：1TRE鉀離子通道能夠穩定細胞膜電位對調節細胞的興奮性發揮著重要的作用。2丁基苯酞三種旋光異構體可以濃度依賴性的抑制C胞上轉染的TRE電流但對通道的電壓依賴性沒有影響左旋丁苯酞是TRE較強的抑制劑。3丁基苯酞旋光異構體可使TREK-位向去極化方向移動對C胞膜電位沒有影響。提示丁基苯酞旋光異構體對細胞膜電位的影響與其對通道的抑制作用相關。4.胞內微透析結果及以前實驗證明左旋丁基苯酞能通過細胞內和細胞外對TRE鉀通道共同發揮抑制作用。5.旋丁基苯酞能部分對抗由花生四烯酸引起的TRE電流的病理性激活。6.溫度由24-5C升高到33-度后,TREK-1度顯著增加。TREK-細胞膜電O位向超級化移動絕對值上升大約每升高℃細胞膜電位上升1-胞膜電位與溫度間存在線性關系。但溫度升高對左旋丁基苯酞抑制TRE的作用可能沒有影響。7大鼠低灌注腦缺血模型中,30mg/療腦組織形態學有定改善,進一步證實了左旋丁基苯肽具有抗腦缺血神經元保護作用。8大鼠低灌注腦缺血模型中,TR通道基因和蛋白表達都顯著增加表明該通道與腦缺血疾病有緊密關聯。9抗腦缺血藥物