基因工程的基本操作程序公開課2、能否用SARS病毒作為基因載體？3、作為載體，若沒有切割位點將怎樣？4、攜帶目的基因的載體是否進入了受體細胞，如何鑒定？5、假如目的基因導入受體細胞后不能復制，將怎樣？1、從化學組成來看，載體應含有什么成分？雙鏈DNA不能目的基因不能插入載體上應有標記基因可能造成基因丟失分子搬運工——載體四環素抗性基因氨芐青霉素抗性基因人胰島素基因目的基因插入點目的基因DNA連接酶目的基因插入點目的基因人胰島素基因目的基因含有四環素的完全培養基含有氨芐青霉素的完全培養基死亡死亡存活存活死亡存活1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定大腸桿菌的受體細胞含有目的基因(2)檢測目的基因是否轉錄出了mRNA在生物____復制___________的核酸合成技術。基因探針通過分子雜交與目的基因結合，產生雜交帶，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。3、將目的基因導入受體細胞基因翻譯產物蛋白質等特性鑒定（個體生物學水平）目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程2、基因表達載體的構建2、利用PCR技術擴增（序列已知）如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？基因表達載體的構建過程基因的轉錄產物mRNARNA－DNA雜合雙鏈①概念：PCR全稱為_______________，是一項將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。4、目的基因的檢測與鑒定短時間內大量擴增目的基因含有氨芐青霉素的完全培養基目的基因是否插入轉基因生物的染色體1、從基因文庫中獲?。ㄐ蛄形粗?、利用PCR技術擴增（序列已知）基因文庫基因組文庫部分基因文庫－－如：cDNA文庫聚合酶鏈式反應一、目的基因的獲取3、人工合成(基因比較小，序列已知)反轉錄法根據已知的氨基酸序列合成DNA（化學合成）依據：目的基因的有關信息。如：根據基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉錄產物mRNA

基因翻譯產物蛋白質等特性從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術。

②原理：__________多聚酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制一段已知目的基因的核苷酸序列蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學合成推測推測人工合成法（基因較小，核苷酸序列已知）mRNARNA－DNA雜合雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA逆轉錄酶DNA聚合酶反轉錄法化學合成法二、基因表達載體的構建（核心）

1.目的A.使目的基因在受體細胞中穩定存在并遺傳給子代B.同時使目的基因能表達和發揮作用2.基因表達載體的組成：a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因質粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA3.基因表達載體的構建過程（1）用_________切割質粒，使其出現切口露出____________。（2）用___________切割目的基因，使其產生_________________。（3）將目的基因插入質粒的______處，加入___________，形成了一個重組DNA分子限制酶黏性末端同種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同三、將目的基因導入受體細胞

------轉化目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程穩定表達受體細胞方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法1、將目的基因導入植物細胞（1）農桿菌轉化法特點:a.能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力b.Ti質粒的T—DNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體上Ti質粒目的基因構建表達載體轉入農桿菌整合植物細胞染色體DNA表達新性狀外源基因導入植物細胞（2）基因槍法特點：成本高適用于單子葉植物2、能否用SARS病毒作為基因載體？根據已知的氨基酸序列合成DNA（化學合成）方法——抗原-抗體雜交①概念：PCR全稱為_______________，是一項基因表達載體的構建過程含有氨芐青霉素的完全培養基抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等使目的基因在受體細胞中穩定存在大腸桿菌的受體細胞含有目的基因2、利用PCR技術擴增（序列已知）如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？含有四環素的完全培養基含有氨芐青霉素的完全培養基如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。將Bt毒蛋白注射小鼠體內部分基因文庫－－如：cDNA文庫(2)檢測目的基因是否轉錄出了mRNA鑒定（個體生物學水平）目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程大腸桿菌的受體細胞含有目的基因（3）花粉通道法我國轉基因抗蟲棉就是用這種方法獲得2、將目的基因導入動物細胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵新性狀動物3、將目的基因導入微生物細胞（1）方法：Ca2+處理法（增加細胞膜通透性）（2）微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少（3）過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA四、目的基因的檢測與鑒定檢測（分子水平）:是否插入目的基因是否轉錄是否翻譯鑒定:個體生物學水平鑒定（1）檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因A方法:DNA分子雜交B過程:1.檢測

基因探針通過分子雜交與目的基因結合，產生雜交帶，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。

(2)檢測目的基因是否轉錄出了mRNA①方法:分子雜交法②過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA。方法——抗原-抗體雜交含有氨芐青霉素的完全培養基a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA在受熱下，_____斷裂，形成________（3）將目的基因插入質粒的______處，加入___________，形成了一個重組DNA分子從基因文庫中獲取目的基因（3）將目的基因插入質粒的______處，加入___________，形成了一個重組DNA分子如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等b、復性（55℃-65℃）：溫度降低，引物與單鏈DNA結合，形成局部________。在生物____復制___________的核酸合成技術。（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質將目的基因導入微生物細胞基因工程的基本操作程序公開課同時使目的基因能表達和發揮作用（2）微生物作受體細胞原因：含有四環素的完全培養基4、目的基因的檢測與鑒定2、能否用SARS病毒作為基因載體？如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法:抗原-抗體雜交提取方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質

出現雜交帶脫分化組織培養2.鑒定（個體生物學水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等目的基因的表達和檢測抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等抗原－抗體雜交法DNA-RNA分子雜交法DNA分子雜交法受體是否具有轉基因特征個體水平目的基因是否翻譯目的基因是否轉錄目的基因是否插入轉基因生物的染色體分子水平方法檢測對象非編碼區非編碼區編碼區外顯子內含子終止子基因的結構啟動子原核真核原核細胞真核細胞不同點編碼區是_____的編碼區是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______和具有調控作用的______區組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續不連續編碼區非編碼基因翻譯產物蛋白質等特性從基因文庫中獲取目的基因抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等化學合成法、反轉錄法(2)檢測目的基因是否轉錄出了mRNA含有氨芐青霉素的完全培養基2、利用PCR技術擴增（序列已知）Ti質粒的T—DNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體上含有氨芐青霉素的完全培養基DNA-RNA分子雜交法（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質1、從化學組成來看，載體應含有什么成分？2、利用PCR技術擴增（序列已知）同時使目的基因能表達和發揮作用大腸桿菌不含抗四環素基因大腸桿菌不含抗四環素基因DNA-RNA分子雜交法含有四環素的完全培養基②過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA。三、將目的基因導入受體細胞

------轉化編碼區非編碼區非編碼區mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA轉錄剪接逆轉錄復制啟動子終止子基因不含非編碼系列。即不含非編碼區和內含子模板DNAPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物95℃PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束③過程：a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA在受熱下，_____斷裂，形成________b、復性（55℃-65℃）：溫度降低，引物與單鏈DNA結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈④方式：以_____方式擴增，即____⑤條件：前提條件:________________⑥結果：指數2n短時間內大量擴增目的基因已知基因的核苷酸序列根據已知的氨基酸序列合成DNA（化學合成）將目的基因導入微生物細胞方法——抗原-抗體雜交大腸桿菌不含抗四環素基因含有四環素的完全培養基如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少方法——抗原-抗體雜交短時間內大量擴增目的基因大腸桿菌的受體細胞含有目的基因c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。在生物____復制___________的核酸合成技術。三、將目的基因導入受體細胞

------轉化即不含非編碼區和內含子④方式：以_____方式擴增，即____依據：目的基因的有關信息。短時間內大量擴增目的基因將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。①概念：PCR全稱為_______________，是一項原核細胞與真核細胞的基因結構比較DNA復制PCR技術場所解旋方式酶PCR技術擴增與DNA復制的比較高溫解旋酶體外復制主要在細胞核內熱穩定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶（3）人工合成法：

在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成化學合成法、反轉錄法蛋白質mRNADNA推測推測DNADNA合成儀合成根據已知的氨基酸序列合成DNA法：生物某個發育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組DNA與載體連接cDNA文庫反轉錄酶DNA聚合酶導入受體菌中儲存②cDNA文庫的構建-----逆轉錄法：

目的基因所在片段運載體PStⅠDNA連接酶重組DNA運載體自連目的基因自連CTTAAGCTTAAGCTTAACTTAAGGPStⅠ運載體的特點3：

有標記基因

導入接種培養接種培養接種培養接種培養含有四環素的完全培養基完全培養基大腸桿菌不含抗四環素基因證明：不存活含有四環素的完全培養基證明：大腸桿菌含抗四環素基因證明：

大腸桿菌的受體細胞含有目的基因

四環素抗性基因

四環素抗性基因完全培養基存活如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？導入接種培養接種培養接種培養接種培養含有四環素的完全培養基完全培養基大腸桿菌不含抗四環素基因證明：不存活含有四環素的完全培養基證明：大腸桿菌含抗四環素基因證明：

大腸桿菌的受體細胞含有目的基因

四環素抗性基因

四環素抗性基因完全培養基存活如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？基因文庫

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。（便于在不知道目的基因核苷酸序列的情況下，獲得所需的目的基因。）某種生物的