基因工程目錄CONTENTS01基因工程的基本工具02基因工程的基本操作程序03基因工程的應(yīng)用04蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用基礎(chǔ)過關(guān)DNA的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、表達(dá)真原核基因結(jié)構(gòu)基因突變、基因重組胚胎工程基礎(chǔ)過關(guān)一、基因工程的發(fā)展歷程1.分子遺傳學(xué)方面2.微生物學(xué)方面3.生物化學(xué)方面4.其他肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)→DNA可以在同種生物不同個(gè)體間轉(zhuǎn)移DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及自我復(fù)制假說的提出DNA半保留復(fù)制的證明及中心法則的提出限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)

→為DNA切割、連接及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件細(xì)菌中的質(zhì)?！梢宰晕覐?fù)制，并在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功培育轉(zhuǎn)基因煙草基礎(chǔ)過關(guān)一、基因工程的發(fā)展歷程1.分子遺傳學(xué)方面2.微生物學(xué)方面3.生物化學(xué)方面4.其他胰島素氨基酸序列的測(cè)定及密碼子的破譯DNA測(cè)序方法及DNA合成儀問世PCR技術(shù)→為獲取目的基因提供有效手段高通量測(cè)序技術(shù)→實(shí)現(xiàn)低成本測(cè)定大量核酸序列體外重組DNA分子的成功構(gòu)建實(shí)現(xiàn)外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)基因編輯技術(shù)→實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換基礎(chǔ)過關(guān)二、重組DNA技術(shù)的基本工具1.三種工具的來源、作用特點(diǎn)及作用結(jié)果2.從作用實(shí)質(zhì)、化學(xué)本質(zhì)、是否需模板、作用對(duì)象及作用結(jié)果角度

比較DNA聚合酶與DNA連接酶3.作為載體需具備的條件4.噬菌體或某些動(dòng)植物病毒作為運(yùn)載體的原理5.標(biāo)記基因的作用6.DNA粗提取的原理、DNA鑒定的原理7.DNA粗提取選材的要求、操作步驟及注意事項(xiàng)8.DNA鑒定的試劑、條件及現(xiàn)象重難點(diǎn)突破【典例1】（1）質(zhì)粒與擬核中的DNA有哪些相同點(diǎn)：（至少寫出兩點(diǎn)）

①

。

②

。

③

。（2）細(xì)胞膜上的載體蛋白與基因工程中的載體的區(qū)別

①化學(xué)本質(zhì)不同：細(xì)胞膜上的載體：

?；蚬こ讨械妮d體可能是物質(zhì)，如

；也可是生物，如

或噬菌體。

②功能不同：細(xì)胞膜上的載體功能是

;基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”,把

?；瘜W(xué)本質(zhì)和結(jié)構(gòu)相同能夠自我復(fù)制具有遺傳效應(yīng)或都能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成等蛋白質(zhì)質(zhì)粒動(dòng)植物病毒控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞重難點(diǎn)突破

多否【典例2】基礎(chǔ)過關(guān)三、基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟2.目的基因的概念3.比較真核生物與原核生物基因結(jié)構(gòu)的區(qū)別4.獲取目的基因的方法有哪些5.Bt基因的全稱、來源、其所指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)及其作用6.PCR技術(shù)的全稱、原理、目的、產(chǎn)物的鑒定方法及優(yōu)點(diǎn)7.列舉PCR反應(yīng)體系中參與的組分、每循環(huán)過程及結(jié)果8.PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2+的原因9.引物是什么？引物的作用是？設(shè)計(jì)引物的要求是基礎(chǔ)過關(guān)三、基因工程的基本操作程序10.瓊脂糖凝膠電泳的原理、DNA分子的遷移速率與哪些因素有關(guān)11.基因工程的核心步驟是12.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的、基因表達(dá)載體的組成、及各部分的作用13.誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的作用、比較啟動(dòng)子終止子與起始密碼子終止密碼子14.構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，用雙酶切的優(yōu)點(diǎn)15.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些16.轉(zhuǎn)化的概念、農(nóng)桿菌的特點(diǎn)17.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入受體細(xì)胞的步驟（兩次拼接兩次導(dǎo)入），及根據(jù)受體植物的不同，所用的具體轉(zhuǎn)化方法有何區(qū)別基礎(chǔ)過關(guān)三、基因工程的基本操作程序18.原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工，為什么19.目的基因檢測(cè)與鑒定的目的及方法(2)延伸時(shí)需要加入兩種引物，原因是

。(1)兩種引物與模板鏈如何配對(duì)？

。引物的5′端與模板鏈3′端互補(bǔ)配對(duì)【典例3】設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請(qǐng)分別說明理由。DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增重難點(diǎn)突破(3)兩種引物的要求：【典例3】設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請(qǐng)分別說明理由。①引物自身不能環(huán)化②兩種引物之間不能互補(bǔ)配對(duì)③引物長(zhǎng)度不宜過短，防止引物隨機(jī)結(jié)合重難點(diǎn)突破【典例4】下圖表示PCR的前三個(gè)循環(huán)，目的基因位于模板DNA分子中與兩種引物所對(duì)應(yīng)的位置之間，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題：(1)經(jīng)過第幾輪擴(kuò)增后，擴(kuò)增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端？比例是多少？

(2)PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？

不是，PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段。(3)如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？

根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。第3輪；1/4重難點(diǎn)突破如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是

；【典例5】某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。請(qǐng)回答下列問題：二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)重難點(diǎn)突破并且

和

的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是

。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有

的固體培養(yǎng)基?！镜淅?】某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。請(qǐng)回答下列問題：含有質(zhì)粒載體含有重組質(zhì)粒

二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)四環(huán)素重難點(diǎn)突破基礎(chǔ)過關(guān)四、基因工程的應(yīng)用1.列舉基因工程都有哪些方面的應(yīng)用？

列舉基因工程在植物及動(dòng)物方面的應(yīng)用及培育方法2.指出下列基因分別是抗蟲？抗病毒？抗真菌？Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因、病毒外殼蛋白基因、病毒復(fù)制酶基因（缺陷型）、幾丁質(zhì)酶基因、抗毒素合成基因3.干擾素的化學(xué)本質(zhì)、作用機(jī)理及大量生產(chǎn)的方法4.乳腺生物反應(yīng)器的培育過程、該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，藥用蛋白基因在哪里表達(dá)？如何實(shí)現(xiàn)讓藥用蛋白基因只在乳腺細(xì)胞中特異性表達(dá)？基礎(chǔ)過關(guān)5.轉(zhuǎn)基因豬作為器官移植供體的優(yōu)點(diǎn)6.如何解決轉(zhuǎn)基因豬作為器官移植供體的免疫排斥問題7.基因工程菌指的是五、蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用1.蛋白質(zhì)工程的概念、原理、基本思路及出現(xiàn)的原因2.如何利用蛋白質(zhì)工程提高玉米中的賴氨酸含量3.列舉蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用4.改造目的基因的方法有哪些高考真題透析1.（2020年浙江省高考生物試卷（7月選考)·24）下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是（

）A．若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)用到的限制性核酸內(nèi)切酶，則一定有利于該重組質(zhì)粒進(jìn)入受體并保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定B．抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得2個(gè)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入無關(guān)C．抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株，其DNA檢測(cè)均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達(dá)了抗性蛋白而后者只表達(dá)抗性基因RNAD．已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶。用某種限制性核酸內(nèi)切酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后，出現(xiàn)3條帶。表明該質(zhì)粒上一定至少有3個(gè)被該酶切開的位置D2．（2019北京卷·4）甲、乙是嚴(yán)重危害某二倍體觀賞植物的病害。研究者先分別獲得抗甲、乙的轉(zhuǎn)基因植株。再將二者雜交后得到F1，結(jié)合單倍體育種技術(shù)，培育出同時(shí)抗甲、乙的植物新品種，以下對(duì)相關(guān)操作及結(jié)果的敘述，錯(cuò)誤的是A．將含有目的基因和標(biāo)記基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞B．通過接種病原體對(duì)轉(zhuǎn)基因的植株進(jìn)行抗病性鑒定C．調(diào)整培養(yǎng)基中植物激素比例獲得F1花粉再生植株D．經(jīng)花粉離體培養(yǎng)獲得的若干再生植株均為二倍體3．（2019江蘇卷·16）下列生物技術(shù)操作對(duì)遺傳物質(zhì)的改造，不會(huì)遺傳給子代的是A．將胰島素基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選獲得基因工程菌B．將花青素代謝基因?qū)胫参矬w細(xì)胞，經(jīng)組培獲得花色變異植株C．將腸乳糖酶基因?qū)肽膛Ｊ芫?，培育出產(chǎn)低乳糖牛乳的奶牛D．將腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞后回輸患者，進(jìn)行基因治療DD4．（2019天津市七校聯(lián)考）利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)羧酸酯酶（CarE）制劑，用于降解某種農(nóng)藥的殘留，基本流程如圖。下列敘述正確的是A．過程①的反應(yīng)體系中需要加入逆轉(zhuǎn)錄酶和核糖核苷酸B．過程②需使用限制酶和DNA聚合酶，是基因工程的核心步驟C．過程③需要使用NaCL溶液制備感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞D．過程可利用DNA分子雜交技術(shù)鑒定CarE基因是否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞D5．（2018北京卷，5）用XhoI和SalI兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別處理同一DNA片段，酶切位點(diǎn)及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖。以下敘述不正確的是（）A．如圖中兩種酶識(shí)別的核苷酸序列不同B．如圖中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNAC．泳道①中是用SalI處理得到的酶切產(chǎn)物D．圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNAD6．（2017年北京卷，5）為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖牵ǎ〢．用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒B．用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞C．在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞D．用分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上C7．[2014·廣東卷](雙選)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)羧酸酯酶(CarE)制劑的流程如圖所示，下列敘述正確的是（多選）(

)A．過程①需使用逆轉(zhuǎn)錄酶B．過程②需使用解旋酶和PCR獲取目的基因C．過程③使用的感受態(tài)細(xì)胞可用NaCl溶液制備D．過程④可利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導(dǎo)入受體細(xì)胞AD8．（2022·全國(guó)乙卷·高考真題）新冠疫情出現(xiàn)后，病毒核酸檢測(cè)和疫苗接種在疫情防控中發(fā)揮了重要作用?；卮鹣铝袉栴}。(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測(cè)新冠病毒RNA（核酸檢測(cè)）可以采取RT-PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是________，再通過PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷被檢測(cè)者是否感染新冠病毒。(2)為了確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)新冠病毒RNA中的____________________來進(jìn)行。PCR過程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是______。(3)某人同時(shí)進(jìn)行了新冠病毒核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)（檢測(cè)體內(nèi)是否有新冠病毒抗體），若核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性而抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明____________________________（答出1種情況即可）；若核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽性，說明______。逆轉(zhuǎn)錄酶特異性核苷酸序列

復(fù)性曾感染新冠病毒，已康復(fù)

已感染新冠病毒，是患者8．（2022·全國(guó)乙卷·高考真題）新冠疫情出現(xiàn)后，病毒核酸檢測(cè)和疫苗接種在疫情防控中發(fā)揮了重要作用。回答下列問題。(4)常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S（具有抗原性）的編碼序列（目的基因）。為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術(shù)獲得大量蛋白S?；蚬こ痰幕静僮髁鞒淌莀_____。獲取S蛋白基因→構(gòu)建S蛋白基因與運(yùn)載體的表達(dá)載體→導(dǎo)入受體細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定（檢測(cè)受體能否產(chǎn)生S蛋白）9.（2022·湖南·高考真題）水蛭是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質(zhì)工程改造水蛭素結(jié)構(gòu)，提高其抗凝血活性?；卮鹣铝袉栴}:(1)蛋白質(zhì)工程流程如圖所示，物質(zhì)a是__________，物質(zhì)b是_______。在生產(chǎn)過程中，物質(zhì)b可能不同，合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同，原因是_______________________。密碼子的簡(jiǎn)并性氨基酸序列

mRNA9.（2022·湖南·高考真題）水蛭是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質(zhì)工程改造水蛭素結(jié)構(gòu)，提高其抗凝血活性。回答下列問題:(2)蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有_____________________________、___________________________________________和利用PCR技術(shù)擴(kuò)增。PCR技術(shù)遵循的基本原理是____________________。(3)將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產(chǎn)物中的肽含量及其抗凝血活性，結(jié)果如圖所示。推測(cè)兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的______（填“種類”或“含量”）有關(guān)，導(dǎo)致其活性不同的原因是______________________________。從基因文庫中獲取目的基因

通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成

DNA雙鏈復(fù)制種類提取的水蛭蛋白的酶解時(shí)間和處理的酶的種類不同，導(dǎo)致水蛭蛋白空間結(jié)構(gòu)有不同程度破壞9.（2022·湖南·高考真題）水蛭是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質(zhì)工程改造水蛭素結(jié)構(gòu)，提高其抗凝血活性。回答下列問題:(4)若要比較蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡(jiǎn)要寫出實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路________________________________________。取3支試管，分別加入等量的蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動(dòng)物（如家兔）血液，立即將等量的血液加入1、2、3號(hào)三支試管中，靜置相同時(shí)間，統(tǒng)計(jì)三支試管中血液凝固時(shí)間10．（2022·山東）某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(1)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是_______________________________________________、為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。

5'端分別與兩條模板鏈3'端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)

10．（2022·山東）某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(2)PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是______。在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中，限制酶識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的最后兩個(gè)堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個(gè)堿基構(gòu)成一個(gè)密碼子，導(dǎo)致讀碼框改變，翻譯出的氨基酸序列改變。10．（2022·山東）某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(2)PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是______。修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是______。在EcoRⅠ識(shí)別序列前后增加堿基使其堿基數(shù)目加上FLAG的堿基數(shù)目為3的倍數(shù)10.（2022·山東·高考真題）某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(3)融合蛋白表達(dá)成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照?qǐng)D乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推測(cè)，藥物A的作用是__________________________；由②④組或③⑤組的差異推測(cè)，P△中缺失的特定序列的作用是______。(4)根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，藥物A治療該病的機(jī)理是______。藥物A促進(jìn)UBC與FLAG-P的結(jié)合，從而促進(jìn)蛋白P被蛋白酶識(shí)別并降解，達(dá)到治療的目的。促進(jìn)UBC與FLAG-P的結(jié)合P△中缺失的特定序列是與UBC結(jié)合的關(guān)鍵序列11.（2022年1月·浙江·高考真題）回答下列（一）、（二）小題：（二）我國(guó)在新冠疫情方面取得了顯著的成效，但全球疫情形勢(shì)仍然非常嚴(yán)峻、尤其是病毒出現(xiàn)了新變異株——德爾塔、奧密克戎，更是威脅著全人類的生命健康。(4)新冠病毒核酸定性檢測(cè)原理是：以新冠病毒的單鏈RNA為模板，利用__________酶合成DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，然后在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入特異的__________，如果檢測(cè)到特異的雜交分子則核酸檢測(cè)為陽性。(5)接種疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制備技術(shù)要點(diǎn)是：將腺病毒的復(fù)制基因敲除；以新冠病毒的______基因?yàn)槟０搴铣傻腄NA插入腺病毒基因組，構(gòu)建重組腺病毒。重組腺病毒在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生新冠病毒抗原，從而引發(fā)特異性免疫反應(yīng)。在此過程中，腺病毒是作為基因工程中目的基因的______。將腺病毒復(fù)制基因敲除的目的是____________。逆轉(zhuǎn)錄

核酸探針抗原載體使腺病毒失去復(fù)制能力12.（2021年廣東卷）非細(xì)胞合成技術(shù)是一種運(yùn)用合成生物學(xué)方法，在細(xì)胞外構(gòu)建多酶催化體系，獲得目標(biāo)產(chǎn)物的新技術(shù)，其核心是各種酶基因的挖掘、表達(dá)等。中國(guó)科學(xué)家設(shè)計(jì)了4步酶促反應(yīng)的非細(xì)胞合成路線（如圖），可直接用淀粉生產(chǎn)肌醇（重要的醫(yī)藥食品原料），以期解決高溫強(qiáng)酸水解方法造成的嚴(yán)重污染問題，并可以提高產(chǎn)率?；卮鹣铝袉栴}：（1）研究人員采用PCR技術(shù)從土壤微生物基因組中擴(kuò)增得到目標(biāo)酶基因。此外，獲得酶基因的方法還有__________________________。（答出兩種即可）（2）高質(zhì)量的DNA模板是成功擴(kuò)增出目的基因的前提條件之一。在制備高質(zhì)量DNA模板時(shí)必須除去蛋白，方法有_____________________________。（3）研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細(xì)胞、pET20b為表達(dá)載體分別進(jìn)行4種酶的表達(dá)。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，首先應(yīng)制備_________細(xì)胞。為了檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)出酶蛋白，需要采用的方法有___________。（4）依圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個(gè)反應(yīng)體系。若這些酶最適反應(yīng)條件不同，可能導(dǎo)致的結(jié)果是_______________________。在分子水平上，可以通過改變_________________，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶特性的改造和優(yōu)化。

基因文庫中獲取、人工合成法

鹽析法、酶解法或高溫變性

感受態(tài)抗原-抗體雜交技術(shù)

有的酶失活而使反應(yīng)中斷

基因的堿基序列13.（2021年天津卷）乳酸菌是乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌，但耐酸能力較差，影響產(chǎn)量。釀酒酵母耐酸能力較強(qiáng)，但不產(chǎn)生乳酸。研究者將乳酸菌的乳酸脫氫酶基因（LDH）導(dǎo)入釀酒酵母，獲得能產(chǎn)生乳酸的工程菌株。下圖1為乳酸和乙醇發(fā)酵途徑示意圖，圖2為構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)所需的關(guān)鍵條件。(1)乳酸脫氫酶在轉(zhuǎn)基因釀酒酵母中參與厭氧發(fā)酵的場(chǎng)所應(yīng)為___________。(2)獲得轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌株的過程如下：①設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增乳酸脫氫酶編碼序列。為使擴(kuò)增出的序列中編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG轉(zhuǎn)變?yōu)檎婧松锲玫腁TG，且能通過雙酶切以正確方向插入質(zhì)粒，需設(shè)計(jì)引物1和2。其中引物1的5′端序列應(yīng)考慮_______________________和___________。細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)包含BamHI的識(shí)別序列將GTG改為ATG

13.（2021年天津卷）乳酸菌是乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌，但耐酸能力較差，影響產(chǎn)量。釀酒酵母耐酸能力較強(qiáng)，但不產(chǎn)生乳酸。研究者將乳酸菌的乳酸脫氫酶基因（LDH）導(dǎo)入釀酒酵母，獲得能產(chǎn)生乳酸的工程菌株。下圖1為乳酸和乙醇發(fā)酵途徑示意圖，圖2為構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)所需的關(guān)鍵條件。②將上述PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒重組后，導(dǎo)入大腸桿菌，篩選、鑒定，擴(kuò)增重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒上有__________________，所以能在大腸桿菌中擴(kuò)增。啟動(dòng)子存在物種特異性，易被本物種的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識(shí)別并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，因此重組質(zhì)粒上的乳酸脫氫酶編碼序列_____（能/不能）在大腸桿菌中高效表達(dá)。③提取重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入不能合成尿嘧啶的釀酒酵母菌株，在___________的固體培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)基因釀酒酵母，并進(jìn)行鑒定。原核生物復(fù)制原點(diǎn)

不能缺失尿嘧啶13.（2021年天津卷）乳酸菌是乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌，但耐酸能力較差，