激光掃描共焦顯微鏡技術及應用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy本文檔共46頁；當前第1頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術人眼分辨率： 0.2mm光學顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm本文檔共46頁；當前第2頁；編輯于星期二\17點10分二、原理激光掃描共焦顯微鏡技術本文檔共46頁；當前第3頁；編輯于星期二\17點10分原理小結:

Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術本文檔共46頁；當前第4頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術本文檔共46頁；當前第5頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術本文檔共46頁；當前第6頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像本文檔共46頁；當前第7頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片conventionalconfocal本文檔共46頁；當前第8頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別3.增加側向分辨率

本文檔共46頁；當前第9頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別4.由于點對點掃描去除了雜散光的影響

本文檔共46頁；當前第10頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術三.激光掃描共焦顯微鏡的設計特點:1.點照明2.具有照明pinhole和探測pinhole3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦),共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)——逐點掃描成像5.具有多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標記物本文檔共46頁；當前第11頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術技術指標（LeicaTCSSP2):

1.xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61/NA（0.25m)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18m)2.樣品的最大厚度:取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度 Z軸的最大移動范圍(166m、Z-wide)3.樣品的最小光切厚度:(載物臺最小移動距離為40nm）取決于:物鏡的NA、針孔大小Z軸的最小移動步距:40nm Z軸的分辨率:0.35m

本文檔共46頁；當前第12頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術4.激光器

Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm

激光器的特點:1)方向性好:激光基本延直線傳播2)單色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度 集中的。4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合本文檔共46頁；當前第13頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術5.四個熒光通道,一個透射光通道

即除了可同時采集多標記熒光圖像外 還可以同時采集透射光圖像,但透射光 圖像為非共焦圖像。本文檔共46頁；當前第14頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡技術

6.掃描速度:slow220lines/s5125122-3秒slow2440lines/s（2：雙向掃描）

medium450lines/s5125121.7秒medium2900lines/sfast1000lines/s

5125120.7秒1281280.2秒fast22000lines/s7.掃描密度:

646412812851251210241024

20482048本文檔共46頁；當前第15頁；編輯于星期二\17點10分

激光掃描共焦顯微鏡

技術的應用TheapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy本文檔共46頁；當前第16頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用功能.1.多熒光標記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無損傷、連續(xù)光學切片，顯微“CT”3.真正的三維重組4.假三維圖的顯示5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進行光切6.定量分析7.時間序列掃描:xyt、xyzt和xt掃描8.圖像處理9.旋轉掃描10.感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描

本文檔共46頁；當前第17頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用應用定位、定量三維重組動態(tài)測量

活細胞或組織內游離Ca2+分布和濃度的變化測量 (Mg2+、Zn+、Na+、K+)

自由基的檢測藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量蛋白質的轉位本文檔共46頁；當前第18頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用活細胞內H+濃度（pH值）的測量線粒體膜電位的測量熒光漂白恢復（FRAP）的測量籠鎖解籠鎖的測量熒光能量共振轉移（FRET）的測量其他應用本文檔共46頁；當前第19頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用一、定位、定量免疫熒光標記（單標、雙標或三標）的定位、定量：如：細胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細胞器的 共定位、核轉錄因子轉位和干細胞的 增值、分化細胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI末端原位雜交-fitc+PI熒光原位雜交：染色體基因定位

本文檔共46頁；當前第20頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用定位、定量研究中常用熒光探針1.Amine-ReactiveProbes

與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等Green

Red Fura-redFITC494/518TRITC544/572Cy5650/690(異硫氰基熒光素)(四甲基異硫氰基羅丹明)AlexaFluor488488/530PE565/578(藻紅蛋白)TexasRed595/615(德州紅)Cy3558/568BODIPYFL503/512BODIPYTMR543/569BODIPYTR 592/618

本文檔共46頁；當前第21頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用1)細胞表面抗原、胞內某種蛋白免役熒光標記：與抗體耦聯(lián),直標:一抗+熒光探針

間標:二抗+熒光探針如:微管蛋白tublin(抗tublin抗體+熒光探針)肌動蛋白actin(Palloidine+熒光探針)2)細胞膜表面受體 配體+熒光探針如:nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)標記Gm1:霍亂毒素受體霍亂毒素+FITC

本文檔共46頁；當前第22頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用2.標記細胞器熒光探針1)線粒體Mitochondria

Rodamin123505/534，可染活細胞，陽離子,可檢測線粒體膜電位,且在多數(shù)細胞中停留時間短JC1線粒體膜電位低時為單體490/527發(fā)綠光線粒體膜電位高時為多聚體490/590發(fā)紅光可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針MitotrackerGreenFM490/516,染活細胞或固定細胞, 穩(wěn)定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551/576,(氧化型)MitotrackerOrange還原型,只能染活細胞本文檔共46頁；當前第23頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用2)溶酶體

Lysosome

中性紅541/640:微偏堿性,可標記溶酶體等酸性器官

為非特異性AO:LysoTrackerGreenDND-26504/511,染活細胞LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3)內質網(wǎng)

EndoplasmicReticulum

DiOC6484/500:非特異性,較高濃度標記內質網(wǎng),較低濃度標記線粒體4)高爾基體GolgiapparatusNBDC6-ceramie466/536,可染活或死細胞

本文檔共46頁；當前第24頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用細胞器的單克隆抗體5)細胞核PIpropidiumiodide536/617DNA/\RNA死細胞碘化丙啶EBethidiumbromide518/617DNA/RNA死細胞Hochest33342

352/461DNAA-T活細胞Hochest33258

352/461DNAA-T活細胞DAPI358/461DNAA-T半通透細胞ChromomycinA3450/470DNAG-CAO500/526DNA活細胞560/650RNATOTO-1514/533DNA 死細胞SYTO11~1620~24488/520活細胞SYTO11~1620~24521/556活細胞SYTO17 621/634 活細胞本文檔共46頁；當前第25頁；編輯于星期二\17點10分3.GFP綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結合后可產(chǎn)生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實在水母體內還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP,后經(jīng)研究表明，在水母體內Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍色熒光，GFP在藍光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。

將外源基因與GFPDNA相連,GFP可作為外源基因的報告基因實時監(jiān)測外源基因的表達.激光掃描共焦顯微鏡應用本文檔共46頁；當前第26頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用GFP主要應用:

對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態(tài)觀察可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達,如某種轉錄因子的核轉位、蛋白激酶C的膜轉位等。GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉染細胞,可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內質網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器的結構及病理過程可用于觀察分子的運動（FRAP）蛋白之間的相互作用（FRET）本文檔共46頁；當前第27頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用三.動態(tài)測量Physiology:細胞內離子動態(tài)變化測量1).游離Ca2+測量

檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內，被細胞內酯酶水解后并與胞內游離鈣結合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd,Kd和很多因素有關，如pH、Mg2+、與蛋白的結合、溫度等。細胞內生理Ca2+濃度值(10-100nM)，細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）

本文檔共46頁；當前第28頁；編輯于星期二\17點10分熒光探針 激發(fā)波長 發(fā)射波長KdFLuo3-AM,K+,dextran506nm 525nm390nM Fluo4 506nm 525nm CalciumGreen-1507nm 530nm190nMCalciumGreen-2 507nm 535nm550nMFurared 420/480nm 637nm140nMOregonGreen488 494nm 520nm 20,000nMCalciumCrimson 583nm602nm328nMIndo-1 356nm405/458nm230nMFura-2 340/380476nm145nM激光掃描共焦顯微鏡應用本文檔共46頁；當前第29頁；編輯于星期二\17點10分程序化測量：用timelapse中的編程按鈕可進行不同時間序列的掃描測 量。

F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+濃度絕對測量1）單波長公式法Fluo3:530nmKd=450nM[Ca2+]I=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin:細胞內無鈣時的熒光強度(MnCl2)Fmax：細胞內鈣飽和時的熒光強度(A23187)測量時切記細胞內靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低（F值不低于40）激光掃描共焦顯微鏡應用本文檔共46頁；當前第30頁；編輯于星期二\17點10分細胞內生理Ca2+濃度值（10-8-10-7M）細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）2）標準曲線法根據(jù)儀器條件和負載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA-Ca2+)做標準曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強度3）比例熒光的測量.雙波長(比例熒光：ratio)Indo1(360,420/480),fura2(340/380,440)[Ca2+]I=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光掃描共焦顯微鏡應用本文檔共46頁；當前第31頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用快速Ca2+變化的測量1.改變掃描速度2.采用雙向掃描3.減少采樣點數(shù)(犧牲空間分辨率）4.采用線掃描(xt)本文檔共46頁；當前第32頁；編輯于星期二\17點10分細胞器的Ca2+測量1.線粒體內游離Ca2+測量Fluo-3+TMRM(線粒體熒光探針，紅色）2.特異定位的重組水母發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白與Ca2+結合后發(fā)藍光用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體轉染細胞，可測定亞細胞器內的游離Ca2+變化 目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內質網(wǎng)、細胞核內的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測激光掃描共焦顯微鏡應用本文檔共46頁；當前第33頁；編輯于星期二\17點10分

細胞內游離Ca2+測量的應用鈣的特性1．細胞內外的電化學梯度103-104倍2．細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導致胞內鈣明顯升高3．細胞內鈣為細胞激活“開關”細胞內鈣的生理作用1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)2．神經(jīng)遞質的釋放3．學習記憶的增強4．卵子受精5．細胞分裂和再生6．細胞調亡7．細胞間通訊激光掃描共焦顯微鏡應用本文檔共46頁；當前第34頁；編輯于星期二\17點10分8．細胞信號傳導9.DNA合成10.基因表達細胞內鈣超載與疾病1．高血壓、腦缺血、心臟病、內分泌病—胞內鈣濃度異常2．糖尿病、風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化病—胞內鈣濃度增高3．人體缺鈣—骨鈣大量丟失，神經(jīng)細胞的鈣濃度增高4．老化和老年性癡呆-神經(jīng)細胞內鈣濃度增高細胞內生理Ca2+濃度值（10-8-10-7M）細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）激光掃描共焦顯微鏡應用本文檔共46頁；當前第35頁；編輯于星期二\17點10分電刺激引起骨骼肌細胞的Ca2+振蕩激光掃描共焦顯微鏡應用本文檔共46頁；當前第36頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用pH值的檢測：

Snarf-1-AM488nm580/640nm

本文檔共46頁；當前第37頁；編輯于星期二\17點10分自由基的檢測熒光探針：H2DCF-DA（504nm/529nm） 2-氫，2氯熒光素乙酰乙酸鹽胞外H2DCF-DA擴散入細胞內酯酶脫乙酰DCF-H(不熒發(fā)光）DCF（發(fā)熒光）*樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察

Dihydrorhodamine123（507nm/529nm）H2rhod123被動擴散入細胞內在細胞內被氧化成rod123（發(fā)光）激光掃描共焦顯微鏡應用本文檔共46頁；當前第38頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用藥物進入細胞的動態(tài)過程及定位分布

xyzt掃描

本文檔共46頁；當前第39頁；編輯于星期二\17點10分激光掃描共焦顯微鏡應用四.膜電位的測量標記膜電位探針(慢反應）：JC1