實驗十三細胞凋亡的檢測第一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二

實驗目的細胞凋亡的檢測——了解細胞凋亡的檢測方法加深對細胞凋亡現象及本質的理解練習從形態學角度評價細胞凋亡掌握熒光顯微鏡的使用方法第二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡的檢測——

實驗原理基本概念：細胞凋亡(Apoptosis)是指細胞基因調控的一種自主性的自殺現象。或者說在一定的生理或病理條件下，細胞遵循自身的程序，自我結束生命的死亡方式。由于這種死亡方式是由基因調控的死亡過程，因此又稱之為程序性細胞死亡(ProgrammedCellDeath)。細胞凋亡有別于細胞壞死。第三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計數的攻擊、誘導，輕啟著道道程序，逼細胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點一點擰淡;第四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二危難中的細胞啊，你沉穩不亂，DNA片片切割，化云梯直通天堂；細胞體分團相聚，把生命的凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處的伙伴，再見了快樂美好的時光；這一切的一切又融入臨近的胞體，騰出的空間再寫生命的篇章。

第五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡與細胞壞死的區別—————————————————————————————————————————————————————————壞死凋亡1.性質2.誘導因素強烈刺激，隨機發生較弱刺激，非隨機發生3.生化特點4.形態變化6.DNA電泳5.炎癥反應7.凋亡小體8.基因調控被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能細胞結構全面溶解、破壞、細胞腫脹

胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮，核固縮彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈“梯”狀條帶溶酶體破裂，局部炎癥反應溶酶體相對完整，局部無炎癥反應有病理性，非特異性生理性或病理性，特異性無有無第六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡的形態特征（1）凋亡的起始；微絨毛的消失，細胞間接觸的消失，與周圍的細胞脫離，細胞質中，線拉體大體完整，染色質固縮（2）細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面（3）凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞膜所包圍（4）凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。第七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡的形態學特征第八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡與疾病細胞凋亡不足：腫瘤，自身免疫病細胞凋亡過度：心肌缺血，心力衰竭，神經元退行性疾病，病毒感染第九頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡檢測方法基于形態學觀察的染色法基于DNA片斷化的檢測法膜聯蛋白檢測法Caspase酶分析法流式細胞儀定量分析法細胞凋亡的檢測——

實驗原理第十頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二第十一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二第十二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二第十三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二第十四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡的檢測——

實驗儀器、材料及試劑1、儀器、用具：熒光顯微鏡、顯微載玻片、蓋玻片、微量2、培養的細胞材料：HeLa細胞3、試劑：吖碇橙/溴化乙錠（AO/EB)的PBS溶液：PBS溶液中分別加入100μg/mL的AO與100μg/mL的EB，配成兩種溶液，用時再混合。磷酸鹽緩沖液（PBS)：800mL蒸餾水中溶解8gNaCL、0.2gKCL、1.44gNa2HPO4

、0.24g

kH2PO4

，用鹽酸調pH到7.4，加水定容到1L。高壓滅菌保存。移液器、高壓滅菌鍋、細胞培養用具第十五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡的檢測——

實驗步驟（1）Hela細胞貼壁生長于DMEM培養液中含10%胎牛血清，置37℃5%CO2培養箱中培養2~3天，待細胞形成單層融合狀態。（2）去細胞培養液，加入0.215mol/L雙氧水的10%胎牛血清培養液中，繼續培養24~36小時。（3）收集細胞：用細胞消化液消化細胞使細胞脫壁，制成單細胞懸液。1000Xg離心力離心5分鐘，棄上清。（4）取25μl培養的細胞懸液滴于載玻片上，稍風干后，加入AO/EB1:1混合液染色，并蓋上蓋玻片。（5）熒光顯微鏡下觀察。第十六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡的檢測——

注意事項1、EB為強誘變劑，使用時要注意防護2、試劑與細胞孵育完畢后，要立即檢測3、正確使用顯微鏡，保護好鏡頭和濾光片第十七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二細胞凋亡的檢測——

課后作業及思考1、練習用AO/EB法檢測凋亡的細胞，掌握熒光顯微鏡的使用2、查閱相關文獻，理清細胞凋亡與細胞壞死的區別3、了解其它可用于細胞凋亡檢測的方法及其原理第十八頁，共十九頁，編輯于2023年