第2節基因工程的基本操作程序當前第1頁\共有60頁\編于星期三\2點基因工程基本操作的四個步驟：第一步：目的基因的獲取第二步：基因表達載體的構建第三步：將目的基因導入受體細胞第四步：目的基因的檢測與鑒定當前第2頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取1.什么是目的基因？——主要是指編碼蛋白質的結構基因。補充：基因的結構編碼區非編碼區編碼區上游非編碼區編碼區下游啟動子終止子(1)原核基因的結構：與RNA聚合酶結合位點轉錄起點轉錄終點終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄編碼蛋白質(編碼序列)調控遺傳信息的表達(調控序列)啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質當前第3頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取1.什么是目的基因？——主要是指編碼蛋白質的結構基因。補充：基因的結構(2)真核基因的結構：轉錄mRNA前體翻譯肽鏈內含子

外顯子

編碼區非編碼區非編碼區啟動子終止子加工成熟mRNA當前第4頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取1.什么是目的基因？——主要是指編碼蛋白質的結構基因。2.獲取方法：(1)從基因文庫中獲取：①基因文庫：——將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。②基因文庫的分類：按外源DNA片段的來源分類基因組文庫：部分基因文庫：含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因當前第5頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取1.什么是目的基因？——主要是指編碼蛋白質的結構基因。2.獲取方法：(1)從基因文庫中獲取：③獲取目的基因的根據：——根據目的基因的有關信息，例如，根據基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物mRNA，以及基因的表達產物蛋白質等特性來獲取目的基因。④建立基因文庫的目的：——為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。當前第6頁\共有60頁\編于星期三\2點(1)從基因文庫中獲取：⑤基因文庫的構建：基因組文庫的構建：直接分離法(鳥槍法)提取某種生物的全部DNA用適當的限制酶切一定大小的DNA片段將DNA片段與載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫注意：基因文庫的組建過程就包含了基因工程的步驟。目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞當前第7頁\共有60頁\編于星期三\2點(1)從基因文庫中獲取：⑤基因文庫的構建：cDNA文庫的構建：反轉錄法某種生物的單鏈mRNA單鏈互補DNA雙鏈cDNA片段導入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫反(逆)轉錄酶DNA聚合酶當前第8頁\共有60頁\編于星期三\2點(1)從基因文庫中獲取：⑤基因文庫的構建：基因組文庫和cDNA文庫的區別：文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子無有基因中內含子無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以當前第9頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取1.什么是目的基因？——主要是指編碼蛋白質的結構基因。2.獲取方法：(1)從基因文庫中獲取：⑥從基因文庫中獲取目的基因的優點：——操作簡便。⑦從基因文庫中獲取目的基因的缺點：——工作量大，具有一定的盲目性。當前第10頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取2.獲取方法：(2)利用PCR技術擴增目的基因：①什么是PCR？——PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。②PCR的原理：——利用DNA雙鏈復制的原理。③條件：——要有一段已知目的基因的核苷酸序列【前提條件】、四種脫氧核苷酸、引物、熱穩定DNA聚合酶(Taq酶)等。當前第11頁\共有60頁\編于星期三\2點(2)利用PCR技術擴增目的基因：④過程：脫氧胞苷三磷酸脫氧腺苷三磷酸脫氧鳥苷三磷酸脫氧胸苷三磷酸當前第12頁\共有60頁\編于星期三\2點(2)利用PCR技術擴增目的基因：④過程：A.變性(90℃-95℃)：——雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。B.退火(55℃-65℃)：——系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。C.延伸(70℃-75℃)：——在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。D.多次重復：當前第13頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取2.獲取方法：(2)利用PCR技術擴增目的基因：⑤方式：——以指數方式擴增，即2n(n為擴增循環的次數)。當前第14頁\共有60頁\編于星期三\2點⑥PCR技術擴增與DNA復制的比較：PCR技術DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制細胞核內熱穩定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子2.獲取方法：(2)利用PCR技術擴增目的基因：當前第15頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取2.獲取方法：(3)化學方法人工合成：——如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。當前第16頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取練一練：1.多聚酶鏈式反應(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。PCR過程一般經歷下述三十多次循環：95℃下使模板DNA變性、解鏈→55℃下復性(引物與DNA模板鏈結合)→72℃下引物鏈延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關PCR過程的敘述中不正確的是()A．變性過程中破壞的是DNA分子內堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現B．復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D．PCR與細胞內DNA復制相比所需要酶的最適溫度較高C當前第17頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取練一練：2.獲取目的基因的方法有多種，下列不屬于目的基因獲取方法的是()A．從基因組文庫中獲取B．從cDNA文庫中獲取C．從含目的基因生物細胞中獲取D．利用PCR技術獲取C3.

PCR技術擴增DNA，需要的條件是()①目的基因②引物③四種脫氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖體A．①②③④B．②③④⑤C．①③④⑤D．①②③⑥A當前第18頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取練一練：4.有關基因工程的敘述正確的是()A．限制酶只在獲取目的基因時才用B．重組質粒的形成是在細胞內完成的C．質粒都可以作為運載體D．蛋白質的氨基酸排列順序可以為合成目的基因提供線索D5.在基因工程技術中，下列方法與目的基因獲得無關的是()A．輻射誘變法B．從基因文庫中獲取C．反轉錄法D．人工合成法A當前第19頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取練一練：6.下列關于基因工程的說法中，正確的是()

A．基因工程的設計和施工都是在細胞水平上進行的B．目前基因工程所有的目的基因都是從供體細胞中直接分離得到的C．只要檢測出受體細胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功進行表達D．基因工程能使科學家打破物種界限，定向改造生物性狀D當前第20頁\共有60頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲取練一練：7.下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是()①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術擴增目的基因③反轉錄法④通過DNA合成儀利用化學方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③D當前第21頁\共有60頁\編于星期三\2點二、基因表達載體的構建1.構建目的：——使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。2.基因表達載體的組成：目的基因啟動子終止子標記基因當前第22頁\共有60頁\編于星期三\2點二、基因表達載體的構建1.構建目的：——使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。2.基因表達載體的組成：想一想：啟動子、終止子和標記基因分別有什么作用？啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質，但啟動子本身不被轉錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄。標記基因：鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。當前第23頁\共有60頁\編于星期三\2點二、基因表達載體的構建3.構建表達載體：同一種限制酶載體(如質粒)DNA分子(含目的基因)一個切口兩個黏性末端兩個切口(兩個黏性末端)的目的基因基因表達載體(如重組質粒)DNA連接酶當前第24頁\共有60頁\編于星期三\2點二、基因表達載體的構建3.構建表達載體：(1)用一定的_______切割質粒，使其出現一個切口，露出________。(2)用_____________切斷目的基因，使其產生________________。(3)將切下的目的基因片段插入質粒的____處，黏性末端因_________________而相連，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子(重組質粒)。限制酶黏性末端同一種限制酶切口堿基互補配對原則相同的黏性末端DNA連接酶當前第25頁\共有60頁\編于星期三\2點二、基因表達載體的構建3.構建表達載體：特別提醒：(1)用限制酶切割載體和含目的基因的DNA分子時，可以使用不同的限制性核酸內切酶,但是必須切出相同黏性末端。(2)不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具有相同的結構和化學組成，都是雙螺旋結構，都由四種脫氧核糖核苷酸組成，都遵循相同的堿基互補配對原則：A—T，G—C。(3)目的基因與載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。當前第26頁\共有60頁\編于星期三\2點二、基因表達載體的構建練一練：1.如圖為基因表達載體的模式圖，下列有關基因工程中載體的說法錯誤的是(

)A．基因工程的核心步驟是基因表達載體構建B．任何基因表達載體的構建都是一樣的，沒有差別C．圖中啟動子位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作為標記基因，用于鑒別受體細胞中是否導入了目的基因B當前第27頁\共有60頁\編于星期三\2點二、基因表達載體的構建練一練：2.下列操作中不屬于基因表達載體構建過程的是()A.用一定的限制酶切割質粒露出黏性末端B.用同一種限制酶切割目的基因露出黏性末端C.將切下的目的基因片段插入質粒切口處D.將重組DNA導入受體細胞中D3.下列哪項不是基因表達載體的組成部分()A.啟動子B.終止子C.標記基因D.復制原點D當前第28頁\共有60頁\編于星期三\2點二、基因表達載體的構建練一練：4.下列關于基因表達載體的敘述不正確的是()A．啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼B．啟動子和終止子都是特殊結構的DNA短片段，對mRNA的轉錄起調控作用C．標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D．基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別A當前第29頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞1.什么是轉化？——目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。2.常用的受體細胞：——大腸桿菌、枯草桿菌、農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。3.將目的基因導入受體細胞的原理：——借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。當前第30頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞4.將目的基因導入植物細胞：①適用范圍：(1)農桿菌轉化法：——雙子葉植物和裸子植物。小知識：植物的分類依據是否形成種子種子植物裸子植物：松、杉、柏、銀杏被子植物雙子葉植物：花生、大豆單子葉植物：水稻、玉米孢子植物藻類植物：衣藻、水綿、海帶苔蘚植物：葫蘆蘚、地錢蕨類植物：腎厥、滿江紅當前第31頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞4.將目的基因導入植物細胞：②農桿菌特點：(1)農桿菌轉化法：——在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有感染能力。當植物受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農桿菌移向這些細胞，這時農桿菌的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并整合到受體細胞染色體DNA上。當前第32頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞4.將目的基因導入植物細胞：③轉化過程：(1)農桿菌轉化法：當前第33頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞4.將目的基因導入植物細胞：(2)基因槍法：適用范圍：——適用于單子葉植物，但成本較高。當前第34頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞4.將目的基因導入植物細胞：(3)花粉管通道法：適用范圍：——適用于被子植物，且十分簡便經濟。胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊當前第35頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞5.將目的基因導入動物細胞：(1)導入方法：——顯微注射法。(2)過程：——目的基因表達載體提純→從雌性動物內取出卵(卵在體內或體外受精)并進行顯微注射→含目的基因的受精卵→胚胎早期培養至囊胚期再移植到雌性動物輸卵管或子宮，使其發育成具有新性狀的動物。當前第36頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞6.將目的基因導入微生物：(1)原核生物特點：——繁殖快、單細胞、遺傳物質少。(2)方法：——用Ca2+處理細胞→感受態細胞表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子。當前第37頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞知識拓展：(1)不同生物的受體細胞不同：植物一般為體細胞(也可以受精卵)，動物一般為受精卵，微生物一般為大腸桿菌。(2)上圖中發生②與發生①相比，②會使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達，原因是在進行細胞分裂時，細胞核上的DNA經復制后平均分配到兩個子細胞中，保證了親子代遺傳性狀的穩定性，而①細胞分裂時，細胞質是不均分的，子細胞不一定含有目的基因。當前第38頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞練一練：1.基因工程中科學家常采用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，主要原因是()A．結構簡單，操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質含量少、簡單D．性狀穩定,變異少B2.在培育下列作物的轉基因品種時，適合用農桿菌轉化法導入目的基因的是()A．小麥B．玉米C．大豆D．水稻C當前第39頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞練一練：3.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是()①將毒素蛋白注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質粒重組，導人細菌，用該細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養④將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵A.①②B.②③C.③④D.④①C當前第40頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞練一練：4.回答有關基因工程的問題：(1)構建基因工程表達載體時，用不同類型的限制酶切割DNA后，可能產生黏性末端，也可能產生____末端。若要在限制酶切割目的基因和質粒后使其直接進行連接，則應選擇能使二者產生______(相同、不同)黏性末端的限制酶。(2)利用大腸桿菌生產人胰島素時，構建的表達載體含有人胰島素基因及其啟動子等，其中啟動子的作用是__________________________________________________________________________________________。在表達載體轉化大腸桿菌時，常用________處理大腸桿菌，以利于表達載體進入；為了檢測胰島素基因是否轉錄出了mRNA，可用標記的胰島素基因片段作探針與mRNA雜交，該雜交技術稱為____________________。為了檢測胰島素基因轉錄的mRNA是否翻譯成__________，常用____________雜交技術。平相同RNA聚合酶識別和結合的位點，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質人胰島素Ca2＋DNA分子雜交技術抗原—抗體當前第41頁\共有60頁\編于星期三\2點三、將目的基因導入受體細胞練一練：4.回答有關基因工程的問題：(3)如果要將某目的基因通過農桿菌轉化法導入植物細胞，先要將目的基因插入農桿菌Ti質粒的__________中，然后用該農桿菌感染植物細胞，通過DNA重組將目的基因插入植物細胞的_______________上。T－DNA染色體的DNA當前第42頁\共有60頁\編于星期三\2點四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測：(1)導入檢測：即檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因。——這是目的基因能夠在受體細胞中穩定遺傳的關鍵。①方法：——DNA分子雜交技術。②過程：——將轉基因生物的DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中。當前第43頁\共有60頁\編于星期三\2點②過程：放射性同位素標記目的基因的DNA片段TACGGTCATGTCGCATGCTAGATGCCAGTACAGCGTACGATCGTACAGCGTA基因探針待測轉基因生物1染色體DNA單鏈TACGGTCATGTCGCATGCTAG待測轉基因生物2染色體DNA單鏈ATCCGGTGTAGGTCATGCTCGGTACAGCGTA基因探針GTACAGCGTA基因探針顯示出雜交帶不能顯示出雜交帶當前第44頁\共有60頁\編于星期三\2點四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測：(1)導入檢測：即檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因。①方法：——DNA分子雜交技術。②過程：——檢測受體細胞是否具有標記基因所控制的性狀，如果具有標記基因所控制的性狀，就表明受體細胞中含有目的基因，從而可以篩選出含有目的基因的受體細胞。想一想：欲檢測受體細胞中是否含有目的基因，除了DNA分子雜交法外，可以如何檢測？當前第45頁\共有60頁\編于星期三\2點四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測：(2)轉錄檢測：即檢測目的基因是否轉錄出了mRNA。——這是檢測目的基因是否發揮功能作用的第一步。①方法：——(DNA-RNA)分子雜交技術。②過程：——從轉基因生物中提取出mRNA，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與mRNA雜交，如果顯示出雜交帶，就表明目的基因在轉基因生物中已經轉錄出了mRNA。當前第46頁\共有60頁\編于星期三\2點②過程：放射性同位素標記目的基因的DNA片段TACGGTCATGTCGCATGCTAGATGCCAGTACAGCGTACGATCGTACAGCGTA基因探針待測轉基因生物1中的mRNAUACGGUCAUGUCGCAUGCUAG待測轉基因生物2中的mRNAAUCCGGUGUAGGUCAUGCUCGGTACAGCGTA基因探針GTACAGCGTA基因探針顯示出雜交帶不能顯示出雜交帶當前第47頁\共有60頁\編于星期三\2點四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測：(3)翻譯檢測：即檢測目的基因是否翻譯成相應的蛋白質。——這是檢測目的基因是否發揮功能作用的第二步。①方法：——抗原—抗體雜交技術。②過程：——從轉基因生物中提取出蛋白質，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交，如果顯示出雜交帶，就表明目的基因已形成蛋白質產品。當前第48頁\共有60頁\編于星期三\2點②過程：目的基因動物(如小鼠)體內抗體轉基因生物中蛋白質抗原蛋白質表達顯示出雜交帶目的基因已形成蛋白質當前第49頁\共有60頁\編于星期三\2點四、目的基因的檢測與鑒定2.個體生物學水平的鑒定：(1)實例1：一個抗蟲或抗病的基因導入植物細胞后，是否賦予了抗蟲或抗病的特性，需要做抗蟲或抗病的接種實驗，以確定是否具有抗性以及抗性的程度。(2)實例2：有的基因工程產品需要與天然產品進行功能活性比較，以確定轉基因產品的功能活性是否與天然產品相同。當前第50頁\共有60頁\編于星期三\2點四、目的基因的檢測與鑒定練一練：1.1976年,美國的科學家首次將人的生長抑制素釋放因子的基因轉移到大腸桿菌,并獲得了表達，此文中的表達是指該基因在大腸桿菌()A.能進行DNA復制B.能傳遞給細菌后代C.能合成生長抑制素釋放因子D.能合成人的生長素C當前第51頁\共有60頁\編于星期三\2點四、目的基因的檢測與鑒定練一練：2．利用外源基因在受體細胞中表達，可生產人類所需要的產品。下列選項中能說明目的基因完成了在受體細胞中表達的是(

)A．棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因B．大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNAC．山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列D．酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白D當前第52頁\共有60頁\編于星期三\2點五、課堂練習1.基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的,在基因操作的基本步驟中,不進行減基互補配對的步驟是()A.人工合成目的基因B.目的基因與載體結合C.將目的基因導入受體細胞D.目的基因的檢測和表達C當前第53頁\共有60頁\編于星期三\2點五、課堂練習2.下列關于基因工程的敘述，錯誤的是(

)A．目的基因和受體細胞均可來自動、植物或微生物B．限制性核酸內切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性D．載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達D當前第54頁\共有60頁\編于星期三\2點五、課堂練習3.為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。(1)獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用的限制性內切酶作用于圖中的____處，DNA連接酶作用于____處。(填“a”或“b”)aa