淺論FHIT基因過表達對人胃癌細胞系MKN【摘要】目的探討FHIT基因過表達對人胃癌細胞系MKN-45增殖和粘附能力的影響。方法將載有人外源性FHIT基因的真核表達質粒轉染FHIT基因mRNA陰性表達人胃癌細胞系MKN-45，分別用MTT法、平板克隆形成實驗、黏附實驗檢測轉染前后細胞增殖活性、克隆形成能力及粘附能力的變化。結果FHIT基因的過表達可降低MKN-45細胞的增殖和克隆形成能力，但是對MKN-45細胞與內皮細胞的粘附能力無明顯影響。結論FHIT基因過表達可抑制人胃癌細胞系MKN-45的增殖和克隆形成，對于MKN-45細胞與內皮細胞的粘附能力無明顯影響。

【關鍵詞】FHIT胃腫瘤細胞增殖克隆分子基因轉染細胞粘附

Abstract:ObjectiveToevaluatetheeffectsofFHITgeneover-expressiononhumangastriccancercelllineMKN-45proliferationandadhesion.MethodsHumanxenogenouseukaryoticexpressionplasmidweretransfectedtomRNA-negativehumangastriccelllineMKN-45.AMTTassay,plateclony-formingtestandadhesiontestwereperformedtoassesstheMKN-45cells‘proliferativeactivity,clony-formingcapabilityandadhesiveabilitybeforeandaftertransfection.ResultsFHITover-expressioncanreduceMKN-45cells‘proliferationandclony-formingcapability(),butitwasineffectivenessonMKN-45cellsandendothelialcellsadhesion.ConclusionFHITover-expressioncaninhibittheproliferationandclony-formingabilityofhumangastriccelllineMKN-45,itdosenotworkonMKN-45cellsandendothelialcellsadhesiveability.

Keywords:FHIT;gastricneoplasms;cellproliferation;cloning,molecular;genes;transfection;celladhesion

胃癌的發生已被公認是一個多基因、多步驟過程，涉及ras、p27等癌基因，p53、APC等抑癌基因，但完整的胃癌發生基因譜仍不清楚。脆性組氨酸三聯體(fragilehistidinetriad,FHIT)基因是Ohta等于1996年從上皮癌細胞系區域克隆出的一個候選抑癌基因，該基因在所有檢測過的人正常組織中都表達；但在多種腫瘤組織和細胞系中，FHIT基因結構及表達異常［1～3］。我們將成功構建的含FHIT基因的真核表達載體轉染至人胃癌細胞系MKN-45中，得到穩定的過表達，觀察轉染前后MKN-45細胞系增殖、克隆形成、細胞粘附等方面生物學行為的變化，以探討FHIT基因對胃癌的影響。

1材料與方法

材料

細胞系和材料人低分化胃腺癌細胞系MKN-45、人臍靜脈內皮細胞系ECV304，由東南大學臨床醫學院中心實驗室饋贈。真核表達質粒購自Invitrogen公司。

主要試劑RPMI1640培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，脂質體Lipofectamin2000購自美國Invitrogen公司。二甲基亞砜購自上海凌峰化學試劑有限公司，MTT購自Promega公司，其它生化試劑均為分析純。

方法

細胞培養人低分化胃腺癌細胞系MKN-45、人臍靜脈內皮細胞系ECV304，在37℃、5%CO2培養箱中培養，培養液為含10%小牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的RPMI1640。

真核表達質粒的轉染參照說明書，用lipofectamine2000將真核表達質粒轉染至FHIT基因mRNA陰性表達的人胃癌細胞系MKN-45。轉染后采用G418篩選陽性克隆，并且繼續培養。用RT-PCR法檢測FHIT基因mRNA的表達。轉染組細胞有目的基因條帶出現，而轉染空質粒組和陰性對照組均無目的條帶出現，證明轉染成功。

MTT法檢測細胞增殖活性分別收集空白對照組、轉染組和轉染組處于對數期的細胞，調整細胞懸液濃度，分于96孔板，1×104/孔。置37℃，5%CO2培養箱培養使細胞貼壁。根據不同組別，12、36、60、84h后檢測細胞活性。檢測時小心吸去上清，PBS輕輕洗滌，再次棄上清。每孔加入180μl新鮮RPMI1640培養液，再加入MTT溶液20μl，繼續培養4h。終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm或570nm處測量各孔的吸光值。同時設置調零孔，每組設定3復孔。以OD值為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制生長曲線。

平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力分別收集空白對照組、轉染組和轉染組細胞接種在6孔板上，每孔為200個細胞，常規培養20天后姬姆薩染色。沖洗染色液，觀察各平皿細胞克隆的形成數量。

黏附實驗檢測細胞粘附能力變化培養的人臍靜脈內皮細胞系ECV304經PBS洗滌兩次，接種于96孔板。待內皮304細胞長滿96孔板，棄去培養液，PBS洗滌一次。將分別收集的空白對照組、轉染組和轉染組細胞5×104個/孔接種其上。將96孔板放入37℃，5%CO2培養箱培養45min。PBS洗滌兩次，棄去未被吸附的內皮304細胞。加入%RoseBergal，100μl/孔，室溫放置5min，PBS洗滌兩次。加入95%乙醇，200μl/孔,室溫30min，570nm測光密度值。細胞吸光率=總吸光率-內皮細胞吸光率。實驗重復三遍。

統計學分析計量資料以±s表示，采用SPSS統計軟件進行單因素方差分析均數間差別多重比較的LSD(Leastsignificantdifference)檢驗。統計結果的圖形化由Excel2000繪圖程序完成。

2結果

重組質粒轉染MKN-45細胞后FHIT基因mRNA的表達情況細胞有462bp大小的目的基因條帶出現，而MKN-45細胞和MKN-45細胞均無目的條帶出現。

FHIT基因過表達對MKN-45細胞增殖能力的影響隨著細胞培養時間的逐漸延長，轉染組細胞的生長曲線增長幅度較空質粒轉染組及空白對照組細胞降低。細胞生長至84h，轉染組細胞生長曲線明顯低于空質粒轉染組和空白對照組。而空白對照組和空質粒轉染組間差異無顯著性。見表1。

FHIT基因過表達對MKN-45細胞平板克隆形成能力的影響圖3可見轉染組細胞克隆形成能力低于空質粒轉染組和空白對照組。而空白對照組和空質粒轉染組間差異無顯著性。

FHIT基因過表達對MKN-45細胞與內皮細胞間粘附能力的影響各組之間吸光度值差異無顯著性()，提示FHIT基因過表達對MKN-45細胞與內皮細胞間粘附能力無明顯影響，見表2。

圖1轉染MKN細胞后RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

轉染組；空質粒轉染組；3.陰性對照組；Ladder

表1FHIT基因過表達對MKN-45細胞增殖的影響

a：。轉染組與空質粒轉染組和空白對照組相比差異有顯著性

圖2FHIT基因過表達對MKN-45細胞增殖能力的影響

表2FHIT基因過表達對MKN-45細胞與內皮細胞粘附能力的影響

a.空白對照組；空質粒轉染組；轉染組

圖3FHIT基因過表達對MKN-45細胞增殖能力的影響

3討論

Guo等［4］認為FHIT基因與腫瘤細胞增殖及周期無關。但PichiorriF等［5］認為FHIT可通過依賴caspase途徑的凋亡而抑制細胞生長，YoshihitoN等［6］的研究認為，FHIT基因可通過抑制IκB-α的磷酸化進而阻斷NF-κB信號通路而起到抑癌作用。FHIT的激活可通過調控細胞P53凋亡因子的作用而影響腫瘤細胞增殖。我們將轉染至FHIT基因mRNA陰性表達的人胃癌細胞系MKN-45，使其FHIT基因過表達后，MKN-45細胞生長曲線增長幅度較空白對照組及空質粒轉染組低。實驗結果提示FHIT基因過表達可使MKN-45細胞的增殖活性受到抑制，這表明FHIT基因的表達水平可影響到胃癌細胞的增殖活性，該基因可能參與癌細胞增殖的負性調控。FHIT基因在體內和體外均有抑制MEC-1細胞增殖和成瘤性的功能，可降低細胞的分化程度［7］。關于FHIT基因抑制腫瘤細胞增殖的機制，目前認為FHIT基因主要通過其產物FHIT蛋白參與Ap3A的代謝及AMP2酶介導的細胞信號形成，從而阻滯細胞增殖。RenCC等［8］認為FHIT蛋白是一種典型的二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶，能區域特異性地水解ApnA(n=3-6)成為ADP和AMP。FHIT蛋白水解酶活性喪失導致Ap3A水平升高，Ap3A是ATP的類似物，能抑制蛋白激酶的活性。Ap3A水平升高則增強了生長信號轉導途徑，阻斷抑制途徑和凋亡途徑，參與腫瘤的發生。也有研究認為Ap3A是哺乳動物細胞中的一種第二信使，并可導致細胞周期的阻滯。但WaliA等［9］認為FHIT蛋白的抑制腫瘤作用與Ap3A水解酶活性無關，而可能主要依賴FHIT蛋白與底物或其它相關接頭分子的結合。他們把突變型FHIT基因轉染到FHIT缺陷的腫瘤細胞中，發現編碼產物雖無Ap3A水解酶活性，卻同樣能抑制腫瘤細胞在裸鼠體內的成瘤作用。

克隆形成實驗是測定單個細胞增殖能力的有效方法之一。通過計數克隆形成數，可了解細胞的增殖力和對生存環境的適應能力。本實驗結果提示：FHIT基因過表達后，MKN-45細胞的平板克隆形成能力低于空質粒轉染組和空白對照組，而空白對照組和空質粒轉染組間差異無顯著性。這表明FHIT基因可能對胃癌細胞系的克隆形成能力有一定的影響。

腫瘤轉移是一個多階段的復雜過程，粘附是腫瘤侵襲和轉移的始動因素。粘附導致腫瘤細胞在脈管內聚集及穿出管壁向遠隔組織轉移。腫瘤細胞與內皮細胞間的粘附是其穿出脈管的第一步，主要通過腫瘤細胞上的整合素與內皮細胞結合。介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質間相互粘附的為細胞粘附分子。CAMs存在于細胞膜表面或ECM中的跨膜糖蛋白，它們通常以配體和受體相結合的方式而發揮作用。其基本功能是介導細胞粘附，同時參與細胞的信號轉導與活化、細胞的生長及分化、炎癥、腫瘤轉移等一系列重要生理和病理過程。我們通過腫瘤細胞體外粘附實驗模型，來檢測FHIT基因的轉染對人胃癌細胞系MKN-45細胞與內皮細胞粘附能力的影響，結果顯示FHIT基因過表達對于MKN-45與內皮細胞的粘附能力沒有明顯的影響，FHIT基因可能通過別的途徑影響腫瘤細胞的轉移。

綜上所述，我們將轉染至FHIT基因陰性表達的MKN-45細胞使其過表達FHIT基因。比較轉染前后MKN-45細胞生物學行為的改變，結果顯示FHIT基因的過表達使得MKN-45細胞的增殖和克隆形成能力受抑制，提示FHIT基因在胃癌的發生、發展中起著一定的作用，但具體機制尚需進一步研究。

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［4］GuoZ,VishwanathaJK.Effectofregulatedexpressionoftheftagilehistidinetriadgeneoncellcycleandproliferation［J］.MolCellBiochem,2000,204(1-2):83-88.

［5］PichiorriF,TrapassoF,PalumboT,etal.PreclinicalassessmentofFHITgenereplacementtherapyinhumanleukemiausingachimericadenovirus，Ad5/F35［J］.ClinCancerRes,2006,12(11Pt1):3494-3501.

［6］NakafawaY,AkaoY.FHITproteininhibitscellgrowthbyattenuatingthesignalin