引物設計注意事項引物設計在基因的相關研究中極其重要，其中自己比較熟悉的一點是基于引物設計的全長cDNA文庫的構建。全長cDNA序列的獲取是一個十分困難的過程，因此這類數據在GeneBank庫中存儲較少。在過去的試驗中，常見的方法是利用PCR對mRNA序列進行多次擴增，盡可能地獲得“全長”的cDNA序列，但是這樣的方法很難得到完整的UTR區域。自2000后，發展較迅猛的一個方法是日本一個研究所的“Oligbcapping"方法。該方法的過人之處在于：為mRNA的設計了兩個不同的引物。在3‘UTR區域，PolyA信號的存在可以很方便地設計對應的引物，在5’UTR區域，該方法用一段寡聚核甘酸代替mRNA的帽子結構，從而很容易地設計出對應的引物。從理論上講，這種試驗方法可以得到100%的全長cDNA，但是試驗中多種因素的制約，使得該方法得到的cDNA中約有50%?80%的全長cDNA。如果試驗生物學家能夠解決這個難題，那么生物信息中對基因組的研究將會有很大的飛躍。。。汗ing，偶沒有做過相關的試驗，算是拋磚引玉了，，表砸我。。基本PCR引物設計參數引物設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發生錯誤引發的頻率。特異性不好或劣等的引物會產生額外無關和不想要的PCR擴增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環中一對引物擴增的產物與理論上成倍增長量的接近程度。引物長度；特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內，18到24個堿基的寡核苷酸鏈是有很好的序列特異性的。引物越長，擴增退火時被引發的模板越少。為優化PCR反應，使用確保溶解溫度不低于54°C的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性。總的來說，最好在特異性允許的范圍內尋求安全性。每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍;這樣，大多數應用的最短引物長度為18個核苷酸。引物設計時使合成的寡核苷酸鏈（18?24聚物）適用于多種實驗條件仍不失為明智之舉。引物的二級結構包括引物自身二聚體、發卡結構、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體，應控制其AG大于-5.0kcal/mol或少于三個連續的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩定結構的可能性，引物中間或5’端的要求可適當放寬。引物自身形成的發卡結構，也以3’端或近3’端對引物-模板結合影響更大；影響發卡結構的穩定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環結構形式亦有很大的關系。應盡量避免3’末端有發卡結構的引物。引物GC含量和Tm值PCR引物應該保持合理的GC含量。含有50%的G+C的20個堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56?62°C范圍內，這可為有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和Tm值應該協調。協調性差的引物對的效率和特異性都較差，因為降低了伽值導致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高，其錯誤引發的機率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對可能完全不發揮作用。在從一批在特定序列范圍內已合成好的寡核苷酸中選擇一對新的引物時，這種GC含量和Tm值的協調非常關鍵。一般來說，一對引物的Tm值相差盡量不超過2?3攝氏度，同時引物和產物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內較好。引物的額外序列與退火溫度若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結合位點、限制酶切位點或者GC發夾結構可以使用加長的引物。一般說來，引物5’端添加無關序列不會影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進行4到5個擴增循環；然后在假定引物5’端序列已經加入到模板中，計算得出的退火溫度下進行其余的循環。在引物上添加限制酶位點時一個重要的考慮是大多數限制酶的有效切割要求在它們的識別序列的5’端有2至3個非特異的額外堿基，這樣就會增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個缺點是影響溶解溫度的精確計算，而這對于確定PCR反應時的退火溫度又是必須的。對于低于20個堿基的引物，Tm值可以根據Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學參數、從“最近鄰位”的計算方式得到，現有的PCR引物設計軟件大多數都采用這種方式。引物的3’末端核苷酸組成引物3’末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6個核苷酸的錯配應盡可能的少。如果3’末端的錯配過多，通過降低反應的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應幾乎注定要失敗。引物3’末端的另一個問題是防止一對引物內的同源性。應特別注意引物不能互補，尤其是在3’末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現，這樣獲得的PCR產物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產物和天然模板之間產生競爭PCR狀態，從而影響擴增成功。引物3’末端的穩定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的AG。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3’末端穩定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發。需要注意的是，引物3’末端應盡量避免T。實驗證明，以T結尾的引物即使與T,G或C錯配仍可有效延伸。PCR產物的長度及在耙序列內的位置所有的計算機程序都提供對PCR產物長度范圍的選擇。一般說來，PCR產物長度對擴增效率有影響。特定的應用情況下，PCR產物長度部分取決于模板材料。預期產物的特定長度經常取決于應用的需要。若目的是建立測定特異DNA片段的臨床檢驗方法，120?300bp的小DNA擴增產物可能是最好的。產物應具有好的特異性和高的產生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實驗的足夠信息。這一長度范圍的產物可以通過采用兩步擴增循環方法得到，從而減少擴增時間。其他PCR方法有不同的最佳產物長度。例如，通過定量的RNA-PCR檢測基因表達時，產物應該足夠大以便構成競爭性模板，這樣，產物和競爭物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來。這些產物一般在250?750bp范圍內。補充說明若在cDNA序列內找尋PCR引物，需特別注意兩點：首先，盡力將引物和產物保持在mRNA的編碼區域內，因為這是生成蛋白質的獨特序列，不像3’末端非編碼區域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產物與從污染DNA中產生的產物在大小上相區別。若PCR的目的是克隆一個基因或cDNA的特異序列，產物的大小是根據具體應用預選的。在這里，計算機程序可以提供關于期望區域側翼選擇引物對的信息。在選擇用來擴增來自不同物種DNA的引物時，應避開mRNA的5’和3’末端非翻譯區序列，因為它們可能沒有任何的同源性。簡并引物設計設計簡并引物時，一定要檢查靶擴增區域選定氨基酸遺傳密碼的簡并度。很顯然，我們期望選擇簡并度最低的氨基酸，達到提高特異性的目的。充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。應努力避免3’末端的簡并，對于大多數氨基酸殘基來說，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。在一些多義位置使用脫氧次黃嘌吟（di）代替簡并堿基。測序引物設計當然，測序引物的設計一般都由測序公司來完成，如果需要自己設計的話；那么除了按照上面所提到的引物設計通用標準外，還需要注意兩點：測序引物的特異性的標準掌握應該更嚴格一些，也就是說設計時更優先考慮特異性。因為在測序反應中，如果引物與模板在非預期位置退火并引發鏈延伸，會對結果對來很大的干擾甚至造成結果無法識讀。測序引物的Tm值適當高一些。現在大部分測序反應均選用耐熱的測序級DNA聚合酶來催化，并采用PCR的熱循環程序。選用的測序引物的Tm值稍高一些，有助于使反應順利跨過待測模板的二級結構區，也有助于降低非特異反應。探針的設計探針的設計，根據不同的用途各有其設計特點，這里只是就通用的原則進行討論：探針的長短一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。注意G和C的含量努力控制在40-60%，同時一種堿基連續重復不超過4個，以免非特異性雜交產生。探針自身序列不能形成二聚體，也不能有“發夾”結構存在，這一點上的要求就要比普通引物設計嚴格得多。如果探針地靶目標是多個基因的混合物，就必須控制該探針與無關基因之間的相似性在70%以下。PCR中常見問題分析與對策.PCR產物的電泳檢測時間一般認為PCR產物應在48h以內完成電泳檢測，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型就會出現不規則，甚至消失。Troubleshootingguide假陰性，不出現擴增條帶PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量，④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加漠化乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物使用過程中應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20rl、30rl、50rl或100^1，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，否則容易失敗。物理原因：溫度對PCR擴增來說相當重要。如果變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可導致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高，影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下PCR儀或水浴鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。靶序列或擴增產物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內或濺出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現非特異性擴增帶PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次，是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶的量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時，重新設計引物。②減低酶的量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93°C變性，65°C左右退火與延伸，也叫兩步法）。PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。要設計引物首先要找到DNA序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。現在可以在這一保守區域里設計一對引物。一般引物長度為15~30堿基，擴增片段長度為100~600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%?60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌吟或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區域設計引物。同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多于4個連續堿基的互補。引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5’端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3’端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3’端開始的。這里還需提醒的是3’端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則：引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。產物不能形成二級結構。引物長度一般在15~30堿基之間。G+C含量在40%~60%之間。堿基要隨機分布。引物自身不能有連續4個堿基的互補。引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物5’端可以修飾。引物3’端不可修飾。引物3’端要避開密碼子的第3位。PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。引物的特異性引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。避開產物的二級結構區某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（^G。）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。長度寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因為＞38時，最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74°C）,不能保證產物的特異性。G+C含量G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10°C。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80C，其Tm值最好接近72C以使復性條件最佳。堿基礎隨機分布引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌吟或聚嘧啶的存在。尤其3，端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。引物自身引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補堿基不能大于3bp。引物之間兩引物之間不應不互補性，尤應避免3，端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性。引物的3,端引物的延伸是從3,端開始的，不能進行任何修飾。3,端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反應中，引物3,端不能發生錯配。在標準PCR反應體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800umol/LdNTP(四種dNTP各200rmol/L)以質粒(103拷貝)為模板，按95C，25s；55C，25s；72C，1min的循環參數擴增HIV-1gag基因區的條件下，引物3,端錯配對擴增產物的影響是有一定規律的。A：A錯配使產量下降至1/20，A：G和C：C錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。引物的5,端引物的5,端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5,端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。密碼子的簡并如擴增編碼區域，引物3,端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增特異性與效率。特殊目的的引物設計將在有關章節討論。隨著人們對引物的認識，一些引物的計算機設計程序也應運而生，下面將討論有關引物計算機設計方法。關于如何地NCBI驗證在文獻中查找的引物序列是否正確入：進入blast，在窗口中將找到的序列輸進去，點blast，如果序列正確的話得到的結果會顯示出基因名稱，在全長中的位置，可以根據位置算出大小，如果與文獻上的描述吻合，就驗證了你找到的引物序列了。B：copy引物序列進入NCBI的BLAST選項，選shortblastpaste引物序列在對話框，點擊blast點擊新頁面的format按鈕等待C：shortblast比對單個引物，commonblast可以比對引物對。引物對blast:輸入的引物之間用空格或移行隔開；結果顯示，正確的靶序列應是plus/plus+plus/minnus，即在同一序列內出現成上下游關系的兩個反向引物序列。但是有的引物對的比對結果出乎意料：只找到與其中之一相匹配的序列和位置，另一個就沒有了。這種情況多出現在物種間同源序列的引物比對結果和變異速率較快的序列比對結果中。利用BLAST來分析自己設計的引物具體的操作步驟如下：先打開Blast頁面/BLAST/然后第一步、點擊“Nucleotide”這邊的“Searchforshort,nearlyexactmatches^（下圖的1所示）。第二步、等頁面全部出來以后，將上游引物序列或下游引物序列的互補序列輸入或粘貼入“Search”框（下圖的2所示，大小寫都可以）。如果下游引物序列為5'-GCAAGTCCTTGGACTATGCTGG-3'那它的互補序列為5'-CCAGCATAGTCCAAGGACTTGC-3'。可選擇你有搜索的物種或不作任何選擇”（下圖的3所示）。然后點擊“BLAST！”（下圖的4所示，頁面中間的或頁面下端的都可以）。第三步、新頁面完全出來以后，點擊“Format!””（下圖的5所示），會彈出一個新頁面，慢慢等待結果全部出來。第四步、從Blast結果中你就可以看到你的引物序列和哪些基因的某段匹配（下圖的6所示）及其匹配程度（下圖的7所示）了。（Clickthepicturetoseethesource）o當然使用圖1中一行的blastn也可以。不過，“Blastn”和“Searchforshort,nearlyexactmatches”還是有區別的。BLASTProgramSelectionGuide”是從網上下的，pdf文擋。內容包括：CommonBLASTdatabasesProgramSelectionExplanationfortheprogramchoicesAppendix巢式PCR是指用一對半（三條）或兩對引物實現對目的片段的特異性擴增.更精確的來講，用一對半引物的應該叫做半巢式PCR.其步驟就是，先用一對外側引物，擴增模板得到包含你想要的目的片段,比你想要的片段更大的區域.然后用另一對內側引物（即該對引物在第一輪所用的引物的序列內側），將你第一輪擴增得到的PCR產物為模板，再進行擴增.為了節約引物,可以使用一對半引物.即以第一輪擴增中用到的引物中的一個作為第二輪中的一個引物，與第三條引物分別作為上游和下游引物進行半巢式PCR擴增.進行兩輪PCR的目的在于提高擴增的靈敏性.根據文獻報道,經巢式PCR擴增后，產物擴增靈敏度較之第一輪能提高10的3次方倍.你想進行結核桿菌的分型實驗.需要先從NCBI下載該菌所有的核酸序列.經過比對后，找該菌的保守區，在保守區內設計針對所有結核桿菌的通用引物，作為外側引物，實現第一輪PCR.再在不同型別的菌間，找其型保守序列，做為特異性引物，即內側引物再進行第二輪PCR.建議你在將所有結核桿菌的通用引物作為外側引物的原因在于，減少了你設計和驗證引物的工作量，也能把所有的待分型的結核桿菌放在同一個尺度上.用FASTPCR設計簡并引物一、 從別無選擇的蛋白序列設計簡并引物，如：M（A/T）ASV（E/D）NR（Q/H/Y）F你只需要用FastPCR的DNA、Protein互轉功能即可。1、分析可能的組合，如下（FASTAformat）：>1MAASVENRQF>2MTASVDNRHF>3MTASVDNRYF將以上可能序列粘貼到FastPCR,如下圖：(Clickthepicturetoseethesource)二、 、將蛋白序列轉換為DNA序列、結果顯示在result.txt中4、 綜合各簡并序列，將各位置的堿基合并，如下：>DegenerateDNAatggcngcntcngtngaraaycgncarttyatgacngcntcngtngayaaycgncayttyatgacngcntcngtngayaaycgntaytty綜合為：atgacngcntcngtnganaaycgnyantty5、 計算簡并倍數(DegenerateFold)，本例為：1X1X1X1X1X4X1X1X4X1X1X4X1X1X4X1X1X4X1X1X2X1X1X4X2X1X4X1X1X2=1310726、 適當去除末端堿基，用I代替若干N,減少簡并倍數，一般有效簡并引物的簡并倍數<1000,(當然也有例外)。引物設計完成。如下：atgacngcntcnlgtlgalaaycg最后引物簡并倍數為128三、 二、從若干完全保守區設計簡并引物1、輸入保守區蛋白序列>1//MAASVDNRQYARLEPGLNGVVR>2//RKGGALNVCFEGSEDLPGG>3\\MMNNCWFRVKTNVCKPHKGEI>4\\ILLREELDGWAEQYPDRLK(//表示設計Leftprimer，\\表示設計Rightprimer)（Clickthepicturetoseethesource）四、 2、選擇序列為Protein3、 改變PCRprimeroptions（同特異引物設計）4、 選擇PCR類型，，RUN。（同特異引物設計）5、 選擇質量較高的引物，計算簡并倍數（同上）6、 用I代替若干N，減少簡并倍數。引物設計完成。五、 三、介于完全保守于不保守蛋白序列間的簡并引物設計可參照以上兩種引物的設計方法。轉貼第一：引物長度.根據你需要擴增的目的片段長度，你所需引物的長度也不一樣，400-500bp需要引物長度的是18-19bp.2-3Kb則需要24-25bp.第二:GC含量.一般掌握在百分之50左右.第三:引物的3端不能有太多的G\C,即3端最后五個堿基不能超過一半是G或C.第四:根據你的實驗目的，考慮是否需要引入酶切位點.看看樓上的都是轉貼，偶發表一下個人的看法。偶在實驗室一直幫別人設計引物，估計到現在也設計了上百條了吧，在這里談談偶的感想，希望對大家有幫助。1、 設計引物首先以“引物設計原則”為據，當然只是參照，也不能一成不變。具體問題要具體分析。2、 重點考慮5端和3端引物的退火溫度大致相當，GC含量等次考慮之。3、 盡量避免多的二聚體和發夾結構的存在，當然，在設計用于表達的引物時加入酶切位點，肯定會使二聚體的產生幾率增加，這也無可避免。不要顧慮太多。4、 有時為了節省錢，偶經常在一條引物上設計上2—3個酶切位點，當然這么多酶切位點導致引物自身容易產生二聚體，但是只要引物序列與模板序列特異性較好，這些都不成問題。5、 偶經常用primer5設計后，再用OLIGO分析各項指標，盡量使設計的引物各項指標與引物設計原則的要求不會偏離太遠。偶也用DNAman來分析兩條引物之間可能會形成的二聚體等，最后用在線的軟件/biotools/oligocalc作進一步校驗。6、 完成上述幾步，引物就設計完成，然后送去合成。當然，如果批量設計引物，有專門的軟件，經常用的一款是/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgio以上拙見，希望能對大家有用轉貼引物應用核酸序列保守區內設計并具有特異性。引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源產物不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能(^G。)小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2‘-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。引物長度一般在15~30堿基之間。寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2(G+C)+(A+T+，Ln值不能大于38，因為＞38時，最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度(74°C),不能保證產物的特異性G+C含量在40%~60%之間。G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10C。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80C，其Tm值最好接近72C以使復性條件最佳，上下游引物的GC含量不能相差太大。堿基要隨機分布。引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌吟或聚嘧啶的存在。尤其3’端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。引物自身不能有連續4個堿基的互補。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補堿基不能大于3bp引物之間不能有連續4個堿基的互補。兩引物之間不應不互補性，尤應避免3’端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性引物5’端可以修飾。引物的5’端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5’端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。引物3’端不可修飾。引物的延伸是從3’端開始的，不能進行任何修飾。3’端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應中，引物3’端不能發生錯配。引物3’端要避開MM子的第3位。如擴增編碼區域，引物3’端不要終止于MM子的第3位，因MM子的第3位易發生簡并，會影響擴增特異性與效率。軟件的引物設計功能主要體現在兩個方面：首先是引物分析評價功能，該功能只有少數商業版軟件能夠做到，其中以“Oligo6”最優秀；其次是引物的自動搜索功能，各種軟件在這方面的側重點不同，因此自動搜索的結果也不盡相同。據經驗，自動搜索功能以“PremierPrimer”為最強且方便使用，“Oligo6”其次，其他軟件如“VectorNTISuit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都帶有引物自動搜索功能，但搜索結果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自動搜索的基礎上還要輔以人工分析。故認為引物設計軟件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”軟件合并使用，以“Premier”進行自動搜索，“Oligo”進行分析評價，如此可快速設計出成功率很高的引物。確定引物的另外一種方法（自我體會）：查找與研究主題的相關的文章（最好權威雜志），找到使用的引物序列驗證引物的優劣：a.在pubmed上blast，同時找到基因序列，RNA，DNA，cDNA，CCD，在blast的基礎上自己一個一個堿基核對（引物最好跨越外顯子和內含子）；b.還可進一步在引物設計軟件上評分，意義有限，低分的也可進行的很好。去合成就行啦（心中有數）轉貼引物延伸實驗問題與解答1） 什么是引物延伸實驗？引物延伸實驗用于定量mRNA的量，測定低豐度的mRNA的種類。另外引物延伸實驗可標定轉錄產物的5'-端，確定轉錄的精確起始。特異的末端標記的引物退火到RNA鏈的互補區域，隨后用RNA作為模板，用反轉錄酶延伸引物得到cDNA，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析cDNA。cDNA的長度為引物的標記的核苷酸到RNA-5'末端間的堿基數，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA,長度為20-40個核苷酸，與要分析的轉錄產物的5'末端區域互補。延伸產物小于150個核苷酸，可得到最佳分離效果。引物延伸實驗非常靈敏，可檢測2pg的轉錄產物，這相當于1個細胞中的1個RNA。引物延伸實驗非常適合于對單個基因作定量和定性分析。2） 作這樣一個實驗必須用什么試劑？引物延伸實驗需要模板RNA，可用總RNA或poly（A）+RNA。一個特異的末端標記的核苷酸或DNA片段作為引物，用反轉錄酶合成cDNA。除RNA模板和標記的引物，還需要反轉錄酶，AMV或MMLV反轉錄酶、反應溶液、脫氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝膠試劑，和電泳裝置。所得結果用放射自顯影和磷成像儀分析。3） 引物延伸系統中有些什么組分？引物延伸系統中AMV反轉錄酶和反應溶液、焦磷酸鈉、正對照RNA模版和對照引物、去磷酸的PhiX174HinfIDNA標準分子參照物、T4多核苷酸激酶和溶液、樣品溶液、AMV反轉錄酶2X溶液100mMTris-HCl（pH8.3,42oC）、100mMKCl、20mMMgCl2、20mMDTT、2mM每一種dNTP、1mM精胺。PhiX174標準分子參照物和T4多核苷酸激酶用作引物標記，和確定延伸產物長度的標準。對照RNA可得到87個堿基的延伸產物作為正對照。參照技術手冊TB113查閱引物延伸系統和AMV反轉錄酶的其它信息。4） 反應中用焦磷酸鈉的目的是什么？引物延伸反應中用焦磷酸鈉和精胺可增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產生發卡結構。雖然其作用方式未確定，但結果是增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產生發卡結構。MMLV被焦磷酸鈉和精胺抑制，如使用MMLV，放線菌素D可用于增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產生發卡結構。焦磷酸鈉和放線菌素D抑制cDNA第二條鏈的合成。5） 為成功進行引物延伸實驗需對哪些因素作優化？引物延伸實驗中所用的雜交溫度是最關鍵的需優化的因素。一般而言，最高緊密度，或引物和互補序列完全雜交所需的最適條件是，低于引物溶解溫度的5oC。低于最高緊密度的溫度可極大地增加雜交速度。應在不同的緊密度的雜交溫度下作雜交，以控制引物和特異RNA的雜交。增加雜交緊密度時，帶來的延伸產物的丟失表明，引物和相關的卻不是等同的轉錄產物雜交。在堿和雙價陰離子的存在下，RNA在較高溫度會降解，應用甲酰胺雜交操作方案，這可有效降低溶解溫度，因此可使雜交在較低的溫度進行。可在雜交步驟中用以下的溶液:40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mMNaCl、80%的甲酰胺。如用這個雜交溶液，延伸步驟前甲酰胺和鹽需用乙醇沉淀后除去。模板RNA和引物的量需優化。以下討論了所用RNA模板和引物的起始量。反轉錄酶對不同模板使用的效率不同。這部分是由于RNA中存在的次級結構干擾反轉錄酶的聚合酶活力。如產生短的產物，這通常不是一個問題。如用AMV反轉錄酶，延伸溫度可達55oC。每次反應所用RNA的量是多少？每次反應所用RNA和引物的量取決于分析的RNA的種類(總RNA或poly(A)+RNA),目的RNA的相對豐度。如用總RNA，起始量為10ug，但分析稀有信號，每次反應用100ugRNAopoly(A)+RNA每次反應用0.1-1.0ug，具體決定于總RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特異RNA的濃度。在引物延伸分析前需檢查目的RNA的完整。通過凝膠分析總RNA，應有完整的18S和28S核糖體RNA帶。在引物延伸反應中用Northern印跡和RT-PCR分析來確定特定RNA的存在。每次反應所用引物的量是多少？用引物延伸實驗定量RNA，標記的引物必須多于目的RNAo引物應是互補RNA的5-10倍。但一般，總RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。對未分析的轉錄物，初次分析用50ug總RNA和100fmol引物。如所有RNA中與引物互補的位點飽和，測試信號和投入的RNA的量成正比，而不依賴于引物的濃度。引物應至少為20個核苷酸，雜交位點應位于轉錄產物5'-末端下游的100個堿基處，而不會自互補。也可用從限制性酶切片段所得的ssDNA作為探針，長度應不長于50-100個核苷酸，以獲得最佳分辨率。用AMV和MMLV各有哪些優點和缺點？引物延伸反應通常用AMV，AMV性能更好，對次級結構耐受。用AMV的延伸溫度可達55oC,以消除次級結構，但在這樣溫度下，引物延伸反應的得率通常降低。MMLV的最適溫度為37oC，在更高溫度下，MMLV不穩定，但MMLV可合成更長的產物，這一特點對引物延伸反應不適用，因引物延伸反應所得的產物一般較短，為100-500個核苷酸。有哪些因子會導致非特異，短的和多個引物延伸產物？所研究的轉錄的差異程度可導致產生不同長度的延伸產物，它們來源于選擇式剪切和使用不同的轉錄起始位點。差異核RNA的存在也能導致產生多個延伸產物。引物和RNA中相關或無關序列的交叉雜交也會導致非特異延伸產物的產生。產物短于預測可能和RNA模板的降解有關，或者是轉錄產物中次級結構阻制了反轉錄酶的合成，產生斷缺的cDNA。RNA樣品中存在DNA污染同樣可得延伸產物，加放線菌素D(75ug/ml)可抑制這類產物的產生。應作無RNA模板的負對照實驗，以確定所用試劑中無RNA和DNA污染。同時還應用從不表達目的轉錄產物的細胞或組織中提取的RNA模板作負對照實驗。如何計算RNA轉化為cDNA的量？RNA轉化為cDNA的量可對引物延伸產物，和、無RNA、對照實驗的cpm作測量得到。從凝膠中分別切割引物延伸產物和、無RNA、對照實驗中產物，在閃爍液中測定凝膠塊的讀數，可有效平衡聚丙烯酰胺凝膠的湮滅和32P的衰退。以下的例子表明如何計算fmol的RNA轉化為cDNA，在這個例子中，一半的引物延伸產物(20ul/40ul)加入凝膠中作分析。、無RNA、對照實驗的引物濃度為100fmol，一半的反應液加入凝膠中作分析。切割的帶的讀數為：樣品為3912cpm引物為142359cpm首先計算引物cpm/fmol：cpm/fmol=142359cpm/[100fmolX(20/40)]=2847cpm/fmol接下來計算引物延伸產物的fmol，或cDNA：3912cpm/[2847fmolX(20/40)]=2.75fmolcDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。用什么分子標準參照物確定引物延伸產物的精確長度？為確定引物延伸產物的精確長度，應同同位素標記的DNA分子標準參照物對照。DNA分子標準參照物末端作了標記，上變性凝膠前先作變性，引物延伸產物也作變性。長度在20-500核苷酸范圍的分子標準參照物在確定引物延伸產物的長度方面很有用。去磷酸的PhiX174HinfIDNA標準分子參照物非常方便，已去磷酸，可作5'末端標記，分子標準參照物的長度為24-726核苷酸。能用測序膠分離引物延伸產物嗎？用于引物延伸產物分離的聚丙烯凝膠的規格為16X18cm,含8%聚丙烯、7M尿素、1'TBE溶液。這種膠和測序膠很相似，故一般可用測序膠。應注意不使引物延伸產物和自由引物跑到膠外，特別是需對cDNA定量時。+N有關文獻:Krug,MS,andBergerSL(1987)MethEnzymol152,316BoorsteinWRandCraigEA(1989)MethEnzymol180,347SambrookJFreitschEFandManiatisT(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYorkFreemanWM,VranaSL,andVranaKE(1996)Biotechniques20,782作為目前最好、最專業的引物設計軟件，Olig。的功能很強，在這里我們介紹它的一些主要功能：如：普通引物對的搜索、測序引物的設計、雜交探針的設計以及評估引物對質量等等。一，普通引物對的搜索：以Mouse4E（cDNA序列）為例。我們的目的是以Mouse4E（2361bp）為模板，設計一對引物來擴增出600—800bp長的PCR產物。1，點擊“Search"菜單中的”ForPrimersandProbes“命令，進入引物搜索對話框；由于我們要設計的是一對PCR引物，因此正、負鏈的復選框都要選上，同時選上Compatiblepairs。在Oligo默認的狀態下，對此引物對的要求有：a，無二聚體；b，3'端高度特異，GC含量有限定，d，去除錯誤引發引物等。剩下的工作是確定上、下游引物的位置及PCR產物的長度以及引物設計參數。單擊：“searchRanges”按鈕，彈出“SearchRanges”對話框。輸入上游引物的范圍：1—2000，下游引物的位置：100—2300；PCR產物的長度600—800bp。單擊"Paramaters”按鈕進入“SearchParameters”對話框，對話框種分三個活頁，分別是：不同設定，參數以及更多參數。在“普通設定”窗口，為我們提供了對引物非常直觀的設定方法，從高到低分六個等級，最后還有一個用戶定制選項。當我們對引物的各種參數的含義及應該設定多大值并不是特別清楚時，就可以直接設定Veryhigh/High等來完成對引物設計參數的設定。當我們選中“AutomaticallyChangeString”后，Oligo會在引物搜索過程中：如果在高等級設定中無法找到引物對時自動降低一個定級來進行搜索，知道找到引物對。在設計反向PCR引物對時，就選中“InversePCR”復選框。我們還可以讓引物的長度可以改變，以適應設定的Tm值或PE?（PrimeEffitions，引發效率）。也可以限定所選引物對的最大數目。在“Parameters"窗口中，實際上需要我們改動的只有引物的長度，根據試驗的要求作相應的改變，如23nt。其他參數就使用Oligo的默認值，一般無需改變。在“MoreParameters"窗口中，一般也無需作任何改變，直接用Oligo的默認值。4，點擊“確認”一“Ok”進入搜索窗口，再次單擊“OK”后，Oligo自動完成引物對的搜索，并出現一個搜索結果窗口。顯示出得到的引物對數目。5，點擊“Ok”，出現“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7對引物的簡單信息，引物位置，產物長度，最佳退火溫度及GC含量。單擊“Sort”按鈕，可以按產物長度，最佳退火溫度及GC含量從小到大或從大到小的順序排列。點擊任意一對引物，在旁邊馬上彈出一個叫“PCR”的窗口，在窗口中我們可以看到這對引物在模板中的大概位置，最佳退火溫度（該溫度可以直接應用于我們實際PCR中的第二步退火）。另外還有引物的Tm值，GC含量，引發效率，同時還計算出了產物的Tm值于引物Tm值的差異以及引物間Tm值的差異。一般我們盡量保持前者在20度以內，后者在5-6度以內。點擊不同的引物對時，PCR窗口內容同時作相應的改變。要想了解引物的詳細信息，如二聚體，發卡結構形成情況、組成、Tm值和錯誤引發位點等，這時只需點擊“Analyze”菜單中的相應命令，就可以分別得到相關信息。例如點擊“DuplexFormation"，我們就可以得到上游引物間，下游引物間及上下游引物間形成二聚體的情況。同理，“HairpinFormation”，“CompositionandTm”，“FalsePrimingSites”等命令就可以顯示出相關信息。所有這些分析的結果都有助于我們從Olig。搜索得到的多對引物中選擇最佳的引物對。需要說明的是，1，如果一次搜索得到的引物對太多時，我們可以適當提高選定的條件和規定更合適的搜索范圍來減少引物對數；2,引物一般盡量不要在3’端或是離3’端太近的位置形成二聚體，同時二聚體的自有能絕對值盡量小于10;3,對于錯誤引發，在普通PCR中，如果引發效率在160points以上時，就可能出現雜帶，在測序反應中，錯誤引發效率則應該嚴格控制在120points以下。Oligo中每對引物的詳細信息可以直接導出為一個文本文件：首先點擊“File”菜單中的“Print/SaveOptions"，在出現的對話框中的普通設定選中“Selected"；在“AnalyzeI”中選擇需要保存的信息，在“AnalyzeII”中選中PCR。單擊確定按鈕退出，這時再次點擊“File”菜單，Save浮動命令中的“DataSaveas”，選擇路徑及文件名即可。二，測序引物的設計：在oligo中，測序引物設計過程與普通引物設計大部分都很相似。還是以Mouse4E為例，假如我們要在600-800bp的位置設計一條測序引物。Open-Search在“Search”窗口中，選中“SequecePrimer”，同時去除負鏈Search的選中在“SearchRange”窗口，輸入正鏈的600-800bp在“Parameters”中選定veryhigh，引物長度改為18bp結果得到11條測序引物，與普通引物同理，根據其詳細信息就可以挑選到一條最佳的測序引物。三，探針的設計：探針的設計與測序引物設計基本相同，只需使“Search”窗口的探針設計選中，改變探針的長度就可以。四，評估引物對：我們在各種文獻中查到的引物，如果直接進行PCR，往往很難重復別人的實驗結果。這時就想到，是不是引物的質量有問題？能不能用軟件來對這些問題引物進行一些分析呢？答案時肯定的。1，點擊File菜單中的New命令；2，在“EditNewSequence”的窗口中用鍵盤輸入上游引物；3,如果該引物的首位置不是1的話，可以在“Edit”窗口中輸入新的5’端位置數字，如20；點擊Accept/Discard菜單的Accept命令；如果引物序列長度不同于當前的引物的話，可以從“Change”菜單中改變當前的引物長度；選取當前序列為上游引物（點擊“upper”按鈕）；7，從Edit菜單中選取“LowerPrimer”命令，在EditLower窗口中輸入下游引物的序列；8,在Edit窗口的上角處，輸入相應的5’位置；9，選取“AcceptandQuit”命令；如果想讓程序給出最佳退火溫度，在此時的對話框中輸入PCR產物的長度以及GC含量所占百分比，一般哺乳動物的cDNA序列中GC大約占44%。10，點擊OK就可以在“Analyze”菜單中完成各種分析了。我要做的一個基因大約2.5K長的蛋白，引物長24bp,各項指標都符合設計要求,但不論Tm如何變，效果非常差，我在實驗過程中，也碰到過G+C大于80%的蛋白，只有手動設計，但效果不好，還真不知道有啥好辦法，各位老大能否給點建議.關于引物設計，談一點自己的經驗：1引物的保守性與特異性：可以先登陸NCBI,找出要擴增基因的保守區，并在此區域內設計引物;引物的3'端十幾個堿基一定要嚴格配對分析一下引物的Tm值及GC含量:可以用DNAstar等軟件幫助分析，引物二聚體不能太牢固，引物自身不要配對厲害另外，需要注意的是引物3'端不要以A結尾純屬個人經驗：本人自己設計的不超過50對，但幫別人設計不下100對。只是簡單談談自己的看法。1、 選擇自己熟悉的軟件，primer3，5；或者DNAstar等等，根據特殊情況可能需要其他的特有軟件。2、 避免產生引物自己配對和引物2聚體，最好不要有連續3個以上的堿基配對，尤其是g、c。4、 對于指定位置，即鎖定末端引物時可適當放寬條件，不過需要在pcr過程中摸條件啦。5、 軟件生成的引物進行電子pcrUCSC或ncbi都可以。個人比較喜歡ucsc。6、 實際上一般設計的引物都可以批出，后期摸條件很重要，這里就不詳細講了，一般touchdown或剃度PCR都很不錯。PCR原理引物設計載體現代生物技術包括基因工程，蛋白質工程，細胞工程,酶工程和發酵工程等五大工程技術.其中基因工程技術是現代生物技術的核心技術.基因工程的核心技術是DNA的重組技術，也就是基因克隆技術.重組，顧名思義，就是重新組合,即利用供體生物的遺傳物質，或人工合成的基因，經過體外或離體的限制酶切割后與適當的載體連接起來形成重組DNA分子，然后在將重組DNA分子導入到受體細胞中.在我們實驗室就是構建到表達載體中，由抗原組生產融和蛋白.這一講的內容分為’’CR原理引物設計載體選擇PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物.PCR由變性--退火一延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93°C左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸NA模板一引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料,靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的〃半保留復制鏈〃，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板.每完成一個循環需2?4分鐘,2?3小時就能將待擴增的目的基因擴增放大幾百萬倍.（Plateau）.到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝.Pcr體系:Taq酶,dNTP,Primer,Template,buffer.Pcr程序：94C2min;（94C1min,55C1min,72C2min）X25;72C5minPCR擴增產物可分為長產物片段和短產物片段兩部分.短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段.短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的,3'端則沒有固定的止點，長短不一，這就是〃長產物片段〃.進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈（即〃長產物片段"）結合.引物在與新鏈結時，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內，形成長短一致的〃短產物片段〃?不難看出〃短產物片段〃是按指數倍數增加，而〃長產物片段〃幾乎可以忽略不計,這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析.三，引物設計PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段使其能有效地擴增模板DNA序列.合適的區段：1同源性抗體檢測時條帶的單一性；2親水性抗原的水溶性；3抗原性刺激動物產生抗體的強弱；4編碼區同框正確編碼目的蛋白.引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5’端加酶切位點序列;標記生物素，熒光素，地高辛等,這對擴增的特異性影響不大.但3’端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3’端開始的.引物設計的一般原則：引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性.產物不能形成二級結構.引物長度一般在15~30堿基之間.G+C含量在40%~60%之間.堿基要隨機分布.引物自身不能有連續4個堿基的互補.引物之間不能有連續4個堿基的互補.引物5’端可以修飾.引物3’端不可修飾.四，載體介紹（一） 載體基本要求：1自主復制擴增傳代，可以使我們得到大量的載體或者重組的DNA分子（質粒）.由于DNA的復制是始于復制起點的,因此只要一個DNA分子有了復制起點，那么這個DNA分子就可以自主復制.如果一個分子克隆載體有了復制起點，那么該載體就可以在某種生物的細胞中自主復制，因此這個載體就可以多拷貝地存在于某種細胞內.（穿梭載體）2遺傳標記區分重組分子和非重組分子所轉化的細胞相區別.抗性標記（抗生素抗性amp,kan,cml,G418等;重金屬抗性基因Cu,Zn,Cd;代謝抗性基因抗除草劑基因，胸苷激酶基因（TK）.）營養標記;生化標記基因3多克隆位點含有多重不同的酶的位點4載體本身盡量小精簡,不含有或盡量少的含有多余DNA，可以容量較大的外援DNA.5載體的特征是我們充分掌握的例子：pGEX4T-1（二） 載體分類：有很多不同的分類標準質粒載體這一類載體所含的復制起點主要來自不同的原核生物，大腸桿菌和低等真核生物.病毒載體，復制起點是來自病毒DNA.噬菌體入所組建的charon系列，單鏈DNA噬菌體M13組建的M13mp系列載體混合型載體SV40克隆載體的功能或用途來劃分克隆載體，各種基因組文庫和cDNA文庫的建立.pBR322,pOTB7,pCMV-sport,pBLUE,YRp7表達載體，研究基因的表達或是用于大量生產一些有用的轉錄產物或蛋白質pGEX,pET等等.昆蟲載體，昆蟲桿狀病毒載體，多角體蛋白病毒載體AcMNPV，等等.表達了-干擾素（human-interferon）.腺病毒載體adv/eGFP.酵母人工染色體載體，含有酵母染色體端粒，著絲點復制起點等功能序列，可以插入200-500kb的外源DNA,作為基因組研究.演講主題:基因克隆的酶學基礎酶切與連接演講人:馬力演講日期:2004-11-12演講地點:三鷹生物實驗室基因克隆的酶學基礎酶切與連接核酸酶:通過切割相鄰的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而導致核酸分子多核核苷酸鏈發生水解斷裂的蛋白酶.分兩類:1從核酸分子的末端開始，一個核苷酸一個核苷酸的消化降解多核苷酸鏈.核酸外切酶.2核酸內切酶.一,核酸限制性內切酶與DNA分子的體外切割1.概述概念:核酸限制性內切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶.分三類:I,II,IIII型雖然可以識別DNA序列中特定的核苷酸序列，但它的切割作用發生在特異性位點至少1000bp的地方隨機的發生,在基因克隆中沒有什么實用價值.II型在特異性位點上切割，特異性最強，基因工程中大量使用.IIs型移動切割限制酶III型在距離特異性位點3短24-26bp處,特異性比較差，很少用到.寄主控制的限制與修飾現象簡稱R/M體系restrictionmodification類似于免疫體系，他能夠識別自己的dna和外來的dna,并使外來的dna降解.由兩種酶來控制:修飾的甲基轉移酶和核算限制性內切酶.當外源頭的含有核算限制性內切酶特定位點的核算進入細胞時，相應的核算限制酶就會將其降解.但是菌體內的很多核算也同樣含有這樣的序列，這時特異的甲基化酶就起作用了.甲基化酶在內源的部分核算還沒被限制以前就被甲基化了，這種甲基化的核算序列限制性內切酶是無法作用的.2.II型限制性內切酶的基本特性在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子產生斷裂.識別位點有些是連續的，比如ECORIGIAATTC.有些是不連續的比如SATIGCINGC識別位點的共同特征是具有回文結構，即雙重螺旋對稱的結構形式兩個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相對的?(形成粘末端:具有互補的單鏈延伸末端)GIAATTCCTTAAfGECROI位點也有單鏈斷裂部位在DNA分子上是彼此相對的.(形成平末端)比如SMAICCCIGGGGGGfCCC限制片斷末端得連接作用.許多種限制酶切割DNA分子形成得短片斷能夠自發的重新環化起來如果環化分子加熱后又會重新線性化.但是，如果馬上使用連接酶處理，使他們的3-OH基團和5-P基團之間封閉起來，環化就是永久的了.分為:分子間連接和分子內連接.同裂酶和同尾酶裂酶是指一些來源不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶序列.同尾酶對應一類限制酶，他們雖然來源各異，識別的靶序列也各不相同，但都產生相同的粘性末端.例如:BamhI和BclIGlGATCC影響核酸限制性內切酶活性得因素.DNA純度污染在DNA制劑中得某些物質,例如:蛋白質，酚，酒精，異丙醇,EDTA,高鹽離子等.所以在純化過程中,空摔一定要時間充足，要徹底.用微堿得TE洗脫.提高限制內切酶得用量.延長酶切時間擴大酶切體積，使潛在得抑制因素被相應得稀釋.DNA甲基化的程度核算限制性內切酶是原核生物限制-修飾體系的組成部分，因此識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，會強烈的影響酶的活性.通常從大腸桿菌細胞中分離的質粒DNA,都混有特定核苷酸序列的甲基化酶:DAM甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌吟殘基甲基化.dcm甲基化酶，催化cca\tgg序列中內部的胞嘧啶殘基的甲基化.所以在基因克隆中是使用了失去甲基化酶的大腸桿菌制備質粒DNA.3酶切消化反應溫度.酶切標準溫度是37度,但是某些特殊的酶最適合溫度是例外的,比如SmaI是30度.過高或者過低的溫度會使內切酶失去活性.DNA的分子結構.DNA分子的不同構型對限制性內切酶的活性也有很大的影響.當DNA分子為線性的時候最容易，當DNA分子存在二級結構的時候,酶切的活力就會大大降低.5限制性內切酶的緩沖液.緩沖液一般的組成部分包括:氯化鎂,Tris-Hcl,b-巰基乙醇或者dtt,bsa等.適合的二價金屬離子濃度.通常為mg離子.適合的ph通常為7.4左右.二,DNA連接酶與DNA分子的體外連接核算限制性內切酶將DNA分子切割為不同大小的片斷，然而要將不同來源的DNA片斷組成新的雜種DNA分子，還必須將他們彼此連接并且封閉起來.DNA連接酶:能夠催化兩條DNA鏈之間的磷酸二酯鍵.需要一條dna鏈的3'末端有一個游離的羥基-oh,另外一條DNA鏈5'末端有一個磷酸集團.是一種吸能反應，需要能源物質NAD+或者ATP.DNA連接酶并不能連接兩條單鏈的DNA,被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分.即封閉DNA缺口上的缺口nick.而不能封閉裂口gap.機理：影響連接效率的因素：AATP濃度B連接酶濃度C反應時間Dinsert和vector的比值E連接溫度其中連接溫度是影響連接效率的最重要的因素.幾種連接方式.A用粘性末端DNA片斷的連接.用特定限制性內切酶酶切過的質粒載體與以相同酶酶切過的具有粘性末端的DNA片斷連接.載體可能自發的環化，這時可以用堿性磷酸酶處理酶切過的質粒載體，移去末端的5'磷酸基團，這樣質粒載體就不能自發的環化了.而DNA片斷在與這種載體連接后，會留下一個3'-OH和5'-OH的缺口,這種情況下仍然可以導入宿主菌.這種分子在宿主菌中完成缺口的修復.B平端DNA片斷的連接.直接用T4ligase連接.同聚物加尾法.末端脫氧核苷酸轉移酶,它能夠將核苷酸加到DNA分子單鏈延伸末端的3'-OH基團上.當只加入DNA,dATP和末端脫氧核苷酸混合反應物時產生polyA的尾巴.加入dTTP產生polyT尾巴.這樣兩個用互補基團延伸過的DNA和載體，就能連接在一起.(相當于有了個粘末端).銜接物連接法設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基本原理：引物長度一般引物長度為18~30堿基。總的說來，決定引物退火溫度(Tm值)最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度。在引物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5°C在引物長度大于20bp時：62.3C+0.41C(%G-C)-500/length-5C另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時計算出的數值可能會有少量差距。為了優化PCR反應，使用確保退火溫度不低于54C的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。總的說來，每增加一個核苷酸引物特異性提高4倍，這樣，大多數應用的最短引物長度為18個核苷酸。引物長度的上限并不很重要，主要與反應效率有關。由于熵的原因，引物越長，它退火結合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。GC含量一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協調。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。退火溫度退火溫度需要比解鏈溫度低5C，如果引物堿基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數較多，那么可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4C?6C不會影響PCR的產率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55C?75C間變化。避免擴增模板的二級結構區域選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區域。用有關計算機軟件可以預測估計目的片段的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能(AG)小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。與靶DNA的錯配當被擴增的靶DNA序列較大的時候，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測引物末端引物3’端是延伸開始的地方，因此要防止錯配就從這里開始。3’端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。3‘端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反應中，引物3’端不能發生錯配。如擴增編碼區域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增特異性與效率。引物的二級結構引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構，這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補堿基不能大于3bp。兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免3’端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性。為了下一步操作而產生的不完全匹配5’端對擴增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5’端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。額外的堿基或多或少會影響擴增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為了下一步的操作就要作出適當的“犧牲”。PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。要設計引物首先要找到DNA序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。現在可以在這一保守區域里設計一對引物。一般引物長度為15~30堿基，擴增片段長度為100~600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%?60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌吟或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區域設計引物。同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多于4個連續堿基的互補。引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5’端加酶切位點序列;標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3’端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3’端開始的。這里還需提醒的是3’端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則：引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。產物不能形成二級結構。引物長度一般在15~30堿基之間。G+C含量在40%~60%之間。堿基要隨機分布。引物自身不能有連續4個堿基的互補。引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物5’端可以修飾。引物3’端不可修飾。引物3’端要避開密碼子的第3位。PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。引物的特異性引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。避開產物的二級結構區某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（^G。）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。長度寡核苷酸引物長度為15~30bp,一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38，因為＞38時，最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度(74°C),不能保證產物的特異性。G+C含量G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10C。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80C，其Tm值最好接近72C以使復性條件最佳。堿基礎隨機分布引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌吟或聚嘧啶的存在。尤其3‘端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。引物自身引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補堿基不能大于3bp。引物之間兩引物之間不應不互補性，尤應避免3’端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一