一、分離純化是分析的重要過程：針對分析目的不同，對分析對象的要求和采取的措施不同。若分析過程干擾很小，特異性很高，不需要對樣品處理可直接測定。如：抗原及其抗體檢測，配體及其配基等。多數樣品常常需要處理，才能滿足檢測的要求。如：蛋白質結構分析、動力學（變復性）分析、酶學性質研究等，純度要求很高、避免干擾分析。為了保證分析的準確度，避免檢測體系中某些物質的干擾，往往對樣品進行處理。現在是1頁\一共有26頁\編輯于星期五二、分離分析的含義：1、分離過程本身可以是分析過程 樣品干擾嚴重，需通過分離再檢查， 分離過程和分析過程耦合，分析性色譜技術（HPLC、TLC）2、分離過程的分析——優化純化工藝 分離過程管理：定性分析、定量分析、純度、結構和功能分析等3、基本要求：

客觀、準確性，反映分析對象（目的物質）的真實性。4、分析方法要求： 選擇性（特異性）、精確度、靈敏度、重復性等第一節概述現在是2頁\一共有26頁\編輯于星期五三、如何理解分離純化與分析（三個層次）物質的分析離不開分離： 分析要求樣品的純度：對樣品進行分離純化：如蛋白質、核酸等結構與功能關系的分析；物質分離純化過程離不開分析檢測： 分離組分的收集、純度、含量和組分分析；即分離過程管理。分離純化過程即是分析檢測過程： 電泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄層層析(TLC)等；分析是對事物的感知，是眼睛、是手段現在是3頁\一共有26頁\編輯于星期五一、概述1、一般原理：

依據分離對象（物質）的溶解度、大小在相態中的分配等特性對物質進行分離純化。2、基本程序：樣品處理、粗分和精分（例如：蛋白質的分離純化）3、分類：初級分離：沉淀法、膜分離、萃取法、離心法等精制純化： 吸附層析、凝膠過濾、離子交換、疏水性相互作用色譜、反向色譜、親和層析第二節分離與純化現在是4頁\一共有26頁\編輯于星期五二、初級分離（要求：靈活運用）目的——分離對象（物質）初步分離、濃縮、富集的過程。方法及原理：1、沉淀分級分離：鹽析分級：中性鹽（NH4SO4、Na2SO4等等），例如蛋白酶等蛋白質類等電點分級：有機溶劑：熱沉淀：其它： 鹽復合物、酸堿變性、表面活性劑、 三氯乙酸、PEG、重金屬等聯合使用：鹽析—等電點鹽析原理示意圖現在是5頁\一共有26頁\編輯于星期五2、膜分離：膜分離方法及原理：透析，微濾，納濾，超濾，反滲透，電滲析膜材料和特性：有機膜：（醋酸纖維素、硝基纖維素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等）陶瓷膜：陶瓷材料膜組件：管式膜組件，平板式膜組件，螺旋卷式膜組件，中空纖維（毛細管）等應用：菌體分離，小分子產物分離和回收，蛋白質的分離和回收、濃縮和純化等，膜生物反應器。3、萃取：4、離心：分類：低速離心、高速離心、超速離心分離方式：差速離心、浮力密度離心（連續梯度、非連續梯度）5、其它：鹽復合物、酸堿變性、表面活性劑、三氯乙酸、PEG、重金屬等6、聯用方法：膜過濾-鹽析—等電點，離心—萃取，離心-鹽析—等電點等等現在是6頁\一共有26頁\編輯于星期五B：精制分離—色譜分離：（A）精制過程，純度較高（B）方法和原理：流動相和固定相的分配系數不同。分配平衡很快，流動相為平推流。（1）吸附分離技術：吸附—解吸附平衡，固定相（吸附劑）—流動相（洗脫劑）分配系數不同和分配平衡。吸附—解吸附—再吸附的連續過程（固相和流動相之間連續分配的過程）吸附劑：吸附劑的選擇，表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩定性強、成本低廉。吸附劑的選擇：根據吸附劑性質和被分離對象的性質選擇。極性強的吸附劑易吸附極性強的物質，非極性強的吸附劑易吸附非極性強的物質。為了便于解吸附，對于極性大的分離對象，選擇極性小的吸附劑，反之亦然。吸附劑的選擇依靠經驗和多次試驗。現在是7頁\一共有26頁\編輯于星期五吸附劑的種類：羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁等柱層析：羥基磷灰石，[Ca3(PO4)3OH2]，HA，酸性蛋白質、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅膠：含硅醇基團（-Si-OH），氨基酸、甾體激素、皂苷類、類脂和色素等等。薄層層析：例如，硅膠薄層層析和聚酰胺薄膜薄層層析硅膠薄層層析：硅膠板，硅膠H（純硅膠），能用腐蝕性強的顯色劑；硅膠G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅膠）；硅膠CMC（含羧甲基纖維素）；硅膠HF254(含熒光劑的硅膠H)，硅膠板的制備：玻璃板，硅膠制備（加溶劑碾磨），鋪板，活化，活化測定（約1mg蘇丹黃、蘇丹紅和靛酚藍混合物乙酸乙酯溶液點樣，苯做展層劑，Rf大小蘇丹黃>蘇丹紅.靛酚藍，蘇丹黃Rf）0.5，蘇丹紅和靛酚藍Rf之差在0.1—0.2)。分析程序：點樣，展層，顯色。現在是8頁\一共有26頁\編輯于星期五TLC色素指紋圖譜和灰度分析

圖4TLC色素指紋圖譜的圖像灰度分析曲線Fig.4IntensitycurveofpigmentfingerprintingsonTLC圖3色素的TLC指紋圖譜Fig.3ProfileofpigmentsfingerprintsonTLCa,OnceDevelopingMethod.b,

RepeatedDevelopingMethodT1→T11T11T1-4T10T9T8T7T6T5ab重復展層法：展層劑1為石油醚、正己烷、異丙醇、丙酮和甲醇比例=8-10：：：：0.25-0.35；展層劑2為石油醚：正己烷：異丙醇：丙酮，比例為10：0.95：：0.38-0.41。重復展層法呈現的TLC指紋圖譜能將CQV97菌株全色素分辨成11條不同顏色條帶的色素組分，從下而上依次為黃綠色、藍綠、深藍綠、綠色、紫色、黃色、黃色、紫色、紅色、紅棕色和橙黃色現在是9頁\一共有26頁\編輯于星期五聚酰胺薄膜薄層層析：DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），靈敏度10-9~10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定條件下反應。DABTH-氨基酸的薄層層析分析蛋白質序列。Edman降解試劑DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-異硫氰酸酯）進行微量蛋白質序列分析（2—10nmol肽樣品）。現在是10頁\一共有26頁\編輯于星期五單向紙層析現在是11頁\一共有26頁\編輯于星期五雙向紙層析現在是12頁\一共有26頁\編輯于星期五薄層層析現在是13頁\一共有26頁\編輯于星期五（2）凝膠過濾：排阻色譜或分子篩層析，根據分子顆粒大小進行分離原理：分子在篩孔中自由擴散、滲透，由于分子在篩孔中的分配系數不同，將分子分離。排阻的范圍為0—100%。分配系數：分離化合物在內水和外水體積中的比例關系。 Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Vt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和Vg分別為床體積、外水體積、內水體積和介質的體積。分離物質的大小，0<Kav<1，Kav=0或Kav=1，不能分離。現在是14頁\一共有26頁\編輯于星期五常用介質：交聯葡聚糖（SephadexG10—G200）；AmershamBiosciences交聯瓊脂糖（SepharoseCL-4B,CL-6B）SephacrylS系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）Superdex系列（高交聯瓊脂糖-葡聚糖）Bio-BeadsS-X系列（苯乙烯-二乙烯苯）Bio-GelP系列（聚丙烯酰胺）Bio-RadBio-GelA系列（瓊脂糖）TSKgelSW系列（硅膠）TSKgelToyopearlHW系列，親水性聚乙烯醇ToyoSodaTSKgelPW系列親水性聚乙烯TSKgelCW-35纖維素Cellulofine纖維素Chisso現在是15頁\一共有26頁\編輯于星期五操作程序：凝膠選擇和處理（型號和粒度、凝膠用量、凝膠處理）凝膠柱的制備（柱選擇，徑長比約為1:25—1:100，裝柱、柱鑒定），加樣和洗脫（加樣、洗脫、樣品收集，檢測）凝膠柱的再生和保存應用：分離純化，脫鹽和濃縮，去熱源物質、分析檢測（定性、定量、分子量）。現在是16頁\一共有26頁\編輯于星期五（3）離子交換：電荷大小陽離子交換劑：，羧甲基（-O-CH2-COO-）陰離子交換劑：氨基乙級（-O(CH2)2-NH3+）常用介質DEAE（二乙胺基以及）—CelluloseDE-23DEAE—CelluloseDE-52DEAE-SephadexA-50（25）DEAE-SepharosCL-6bDEAE-Bio-GelACM-CelluloseDE-52CM-CelluloseDE-32CM-SephadexC-25(50)洗脫方式，梯度洗脫，線性和非線性洗脫應用：物質分離、測定等電點（PI）現在是17頁\一共有26頁\編輯于星期五現在是18頁\一共有26頁\編輯于星期五分離純化洗脫曲線和紫外吸收光譜圖3.A菌80%鹽析浮質DEAE-52層析洗脫曲線圖4.A菌不同鹽濃度洗脫組分吸收光譜（a、b、c）。注：a、b、c中7個峰分別對應不同NaCl濃度，：峰3、4為0.05~0.10M洗脫組分，峰5、6、7為0.1~0.15M洗脫組分，峰8為0.15~0.2M洗脫組分，峰9為0.20~0.30M洗脫峰。峰8稀釋6倍。圖7、8、9.分別為A菌Peak34、Peak7和Peak8組份分子篩層析結果。圖7圖8圖9注：圖均為280nm、380nm和480nm檢測波長下的洗脫曲線，此外圖中綠線代表鹽濃度；圖7中b為主要目標蛋白，圖8中a為主要目標蛋白，圖9中a為主要目標蛋白；圖中標注各主要目標蛋白洗脫時間和洗脫體積，以及洗脫流速。A菌現在是19頁\一共有26頁\編輯于星期五（4）疏水性相互作用色譜，利用疏水作用不同將蛋白質等大分子分離，利用表面偶聯弱疏水性基團（疏水性配基）的疏水吸附劑為固定相，蛋白質等大分子與疏水吸附劑之間弱疏水作用的差異進行物質的分離。疏水吸附材料，含有苯基、辛基、丁基、醚基的吸附材料高鹽溶液中吸附能力強，降低鹽度將物質洗脫分離。成本高，實驗室規模分離現在是20頁\一共有26頁\編輯于星期五（5）反向色譜：利用表面非極性的介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，或極性有機溶劑（甲醇、乙腈等），進行物質分離的方法。特點是固定相表面完全被非極性基團覆蓋，具有強的疏水性。介質：以硅膠為載體，經硅烷化連接C4、C8、C18烷基或苯基，常用C18硅烷化類別：制備型色譜和分析型色譜，應用：物質的分離和檢測（定性和定量分析）現在是21頁\一共有26頁\編輯于星期五反向C18層析柱液相色譜儀層析示意圖樣品：沼澤紅假單胞菌現在是22頁\一共有26頁\編輯于星期五（6）親和層析固定相：特異性吸附材料，如酶抑制劑、抗原—抗體、A蛋白、配體—配基、過渡金屬離子（Cu、Ni、Zn、Co等離子）與O、S、N等供電子基團形成配位鍵。與蛋白質表面組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基、色氨酸的吲哚基發生親和作用。如Ni柱分離帶有組氨酸標簽的工程蛋白。程序：選擇凝膠、專一性合成、分析鑒定、裝柱上樣、吸附、清洗、解析，柱再生解析劑：低pH、高鹽、競爭性洗脫劑、鹽酸胍

尿素等變性劑，再生：高濃度鹽應用：物質分離、測定活性現在是23頁\一共有26頁\編輯于星期五四、分離純度的鑒定方法電泳、色譜（薄層色譜、凝膠色譜）、質譜、結晶、N-分析、熔點等現在是24頁\一共有26頁\編輯于星期五五、分離過程的控制及檢測1、純化方案的設計（1）目的：從原材料中提取純化目的成分（分離對象），設計方案，指導分離過程。（2）依據：分離對象的性質和特點（溶解度、電荷、分子大小、與配體親和力等），結合分離純化方法的特點，對分離方法進行比較分析，選擇出一種或幾種方法的組合。（3）原則：各種分離方法各有特色，操作程序簡繁不一；考慮分離對象的特性和結構以及取材的特點，深入了解各種分離方法的原理和用途，合理、巧妙地設計純化方案，純化方案中，忌諱一種分離方法重復使用，純化效率不高，反而降低回收率。分離方案不是僵化的，在實驗中，對方案及所選方法進行不斷修正、調節、完善。（4）分離方法的測試——分離過程檢測 定向分離、靶向分離——都離不開分離對象的檢測與分析