學習從酵母中提取RNA和鑒定RNA組分的方法。一、實驗目的第一頁，共13頁。二、原理：核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)

磷酸(phosphate)核糖(ribose)嘌呤（嘧啶）堿Purine(pyrimidine)base核苷(nucleoside)

第二頁，共13頁。RNA(ribonucleicacid)背景知識

細胞RNA通常都是單鏈分子（但病毒RNA雙鏈、環狀、線型等多種形式），由核糖、堿基（A、U、G、C）和磷酸組成，其種類繁多。目前有許多具有特殊功能的RNA不斷被發現，幾乎涉及細胞功能的各個方面，其中參與蛋白質合成的RNA有三類：轉移RNA（transferRNA）、核糖體RNA（ribosomal）和信使RNA（messengerRNA）。研究表明，RNA不僅僅是遺傳信息的中間傳遞體（fromDNAtoprotein）。RNA的功能總結起來可以分為以下幾類：控制蛋白質的合成；作用于RNA轉錄后加工與修飾；基因表達與細胞功能的調節；生物催化與其他細胞持家功能；遺傳信息的加工與進化。第三頁，共13頁。

RNA和DNA分別存在于細胞質和細胞核中，分離提出核酸，首先要將破碎制成勻漿、使核酸充分提取出來。酵母核酸中RNA含量較多RNA可溶于堿性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。但蛋白質的存在干擾核酸的測定，因此在沉淀中加入95%乙醇溶液洗滌，以除去蛋白，由此可得到RNA的粗制品。RNA的分離第四頁，共13頁。RNA在硫酸液中煮沸可水解成核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸，可分別進行鑒定。組分鑒定

核糖+（嘌呤堿or嘧啶堿）+磷酸核苷酸第五頁，共13頁。三、材料與試劑1、酵母2、0.04mol/L的NaOH溶液3、酸性乙醇溶液

0.3mL濃鹽酸加入到30mL乙醇中4、95％乙醇溶液5、乙醚6、1.5mol/L硫酸溶液7、濃氨水8、0.1mol/L硝酸銀溶液9、三氯化鐵濃鹽酸溶液

2mL10％三氯化鐵加入到400mL濃鹽酸中10、苔黑酚乙醇溶液

6g苔黑酚溶于100mL95％乙醇（4℃保存）11、定磷試劑（１）17％的硫酸溶液（２）2.5％鉬酸氨溶液（３）10％抗壞血酸溶液（４）蒸餾水使用時按下比例臨時配置（體積比）：17％的硫酸溶液:2.5％鉬酸氨溶液:10％抗壞血酸溶液:蒸餾水＝1:1:1:2第六頁，共13頁。四、實驗步驟１、酵母RNA的提取：取酵母1.0g（3片）、0.04MNaOH+8ml研磨勻漿沸水浴20min離心10min（3000r/min）冷卻至室溫收集上清液于離心管

離心管中加入7mL酸性乙醇沉淀RNA離心3min（3000r/min）收集沉淀95%乙醇洗沉淀一次，無水乙醇洗沉淀一次離心3min（3000r/min）沉淀即為RNA粗品離心3min（3000r/min）第七頁，共13頁。2、RNA組分的鑒定RNA的水解：用10m1.5mol/L硫酸溶液小心將RNA沉淀洗至試管中，沸水浴10min，冷卻后離心，然后將上清液定容至100mL,分別取1mL至兩個1.5mLEp管中留做定量用,余下做定性分析。第八頁，共13頁。RNA組分的鑒定：（１）嘌呤堿

取水解液1ml+濃氨水（5滴）+1mlAgNO3，觀察嘌呤銀化合物的絮狀沉淀。（２）核糖取0.5ml水解液+0.2ml苔黑酚+2ml三氯化鐵鹽酸溶液，沸水浴10min，觀察顏色變化（亮綠色）（３）磷酸取0.2ml水解液+0.8ml水+1ml定磷試劑，沸水浴10min，觀察顏色變化（藍色）第九頁，共13頁。五思考題

１、如何得到高產量的RNA粗品？２、本實驗RNA組分是什么？怎樣驗證？第十頁，共13頁。無水乙醇洗沉淀一次離心3min（3000r/min）沉淀即為RNA粗品第十一頁，共13頁。用10ml1.5mol/L硫酸溶液小心將RNA沉淀洗至試管中，沸水浴10min，冷卻后離心，然后將上清液定容至100mL,分別取1mL至兩個1.5mLEp管中留做定量用,余下做定性分析。第十二頁，共13頁。（２）核糖取0.5ml水解液+0.2ml