植物組織培養園藝課件1第1頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.1.1.2無菌操作室⒈功能⒉組成緩沖室（間）：接種室（間）：⒊無菌操作室的消毒⒋主要設備超凈工作臺金屬器械消毒器2第2頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.1.1.3培養室功能主要設備環境條件

3第3頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.1.1.4溫室功能4第4頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.1.2組培實驗室的布局

2.1.2.1布局基本要求便于隔離，便于操作，便于滅菌和便于觀察。

2.1.2.2基本布局規律根據實驗操作程序排列實驗室；接種室和培養室設在與外界環境隔離性好的區域；滅菌室與接種室相鄰；其他實驗室的布局可根據條件，以方便使用為宜。5第5頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五培養室準備室滅菌室儲藏室接種室緩沖室植物組織培養實驗室布局示意圖6第6頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.1.2.3設計組培實驗室時的注意事項為了減少污染，實驗室最好設一走廊且走廊上方最好安裝紫外燈；培養室最好設在南面，設大玻璃窗，以雙層玻璃窗為最好。如果培養室是設在房屋的邊側，其東邊或西邊的墻上也可設置大玻璃窗；培養室房間及門要小，而且密閉性要好，最好裝移門；無菌操作室要小，要設緩沖間，也最好裝移門，且門要稍大一些。7第7頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.1.3組培實驗室的基本設備

2.1.3.1器皿和器械類⒈玻璃器皿⒉器械鑷子類解剖刀剪刀接種針細菌過濾器

8第8頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.1.2.2儀器設備⒈無菌操作設備超凈工作臺9第9頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五高壓蒸汽滅菌器10第10頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五電熱烘箱接種器具消毒器11第11頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五⒉培養設備空調加濕器和去濕機定時器培養架搖床或旋轉床培養箱12第12頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五⒊藥品貯存和配制儀器設備冰箱天平酸度計⒋觀察分析儀器設備體視顯微鏡普通光學顯微鏡倒置顯微鏡⒌其它儀器設備離心機恒溫水浴鍋13第13頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.2培養基組培中培養基的重要性：基本培養基：指只含有維持離體植物細胞基本生命活動所需的營養成分的培養基。通常包括水分、無機營養成分和有機營養成分，不包括激素和天然有機附加物。完全培養基：指在基本培養基的基礎上另外附加激素或天然有機附加物所組成的培養基。14第14頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.2.1培養基的構成

2.2.1.1水

2.2.1.2無機鹽類大量元素化合物微量元素化合物

2.2.1.3有機營養成分糖類維生素類氨基酸類15第15頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.2.1.4植物生長調節劑1、生長素類常用類型：NAA,2,4-D,IBA,IAA功能培養基中常用濃度：10-7～10-5mol/L或0.1～10mg/L16第16頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2、細胞分裂素類常用類型：6-BA,KT.TDZ,2-ip功能培養基中常用濃度：10-7～10-5mol/L或0.1～10mg/L17第17頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五3、組織培養時，植物激素的使用規律在生長素存在的條件下，細胞分裂素的作用有加強的趨勢，但二者在使用上有一定的順序關系，處理順序不同，培養物的分化狀態也不同。規律如下：

⑴先用生長素處理，后用細胞分裂素處理，有利于細胞分裂，但細胞不容易分化,容易產生多倍體細胞。

18第18頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

⑵先用細胞分裂素處理，后用生長素處理，細胞分裂也分化。⑶用生長素和細胞分裂素同時處理，細胞脫分化后分化頻率提高。但二者的使用濃度比值可以決定器官分化方向：生長素/細胞分裂素比值高時，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值適中時，促進愈傷組織的形成和生長。19第19頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.2.1.5天然有機添加物質椰汁：CM100～150ml/L酵母提取液：YE0.01%～0.5%番茄汁：5%～10%馬鈴薯汁：100g/L～200g/L香蕉泥（汁）：150mg/L～200mg/L20第20頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.2.1.6培養基的pH值滅菌前pH值調控范圍：pH=5.7～5.8pH對培養基凝固的影響pH調節劑2.2.1.7凝固劑⒈瓊脂：用量范圍：3～10g/L影響瓊脂凝固的因素⒉Gelrite：植物凝膠2.2.1.8其他添加物活性炭（AC）、維生素C、抗生素等21第21頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.2.2基本培養基的選擇

2.2.2.1基本培養基的類型⒈高無機鹽含量的培養基代表類型：MS，LS，BL，ER⒉硝酸鉀含量較高的培養基代表類型：B5，N6，SH⒊中等無機鹽含量的培養基代表類型：Nitsch，Miller，H⒋低無機鹽含量的培養基代表類型：White，WS，HE

22第22頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.2.2.2基本培養基的選擇MS培養基B5培養基N6培養基改良的White培養基WPM培養基★培養基是否適合所培養的植物，必須通過試驗進行篩選。23第23頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.2.3培養基的配制

母液稀釋法2.2.3.1培養基母液的配制和保存

1、基本培養基母液的配制

⑴單配法⑵混配法①按照避免難溶性沉淀形成的原則和物質種類的不同，將基本培養基配方所包括的物質進行分組；24第24頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

②基本培養基配方中物質劃分組數的多少，即配制母液數的多少可根據實際情況而定，如MS培養基可以配制三液式、四液式、五液式等；例如：MS培養基五液式大量元素母液鈣鹽母液微量元素母液鐵鹽母液有機營養成分母液

25第25頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

2、激素母液的配制⑴激素母液的濃度1～10mmol/L或0.1～1mg/L⑵配制方法生長素類細胞分裂素類⑶培養基的保存26第26頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

2.2.3.2培養基的配制水準備母液混合定容調pH加入瓊脂糖加熱溶解

培養器皿清洗干燥分裝封口高壓蒸汽滅菌冷卻凝固接種培養基具體配制操作過程：P21培養基配制程序27第27頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.3組培實驗基本操作技術

2.3.1器皿和器具的洗滌P191.洗滌劑：無磷中性的肥皂粉、洗衣粉和洗潔精2.常用清洗方法洗滌劑清洗法超聲波清洗法

28第28頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五3.玻璃器皿的清洗新購置的玻璃器皿的清洗用過的培養器皿的清洗已經污染的玻璃器皿的清洗29第29頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.3.2滅菌

2.3.2.1器具的滅菌方法干熱滅菌法高壓蒸汽滅菌法（濕熱滅菌法）火焰灼燒滅菌法

2.3.2.2培養基的滅菌方法高溫蒸汽滅菌法過濾除菌法30第30頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五培養基滅菌方法

-------濕熱滅菌法培養基濕熱滅菌最少時間

液體容積（ml）121℃所需時間（min）

20---50157520250---500251000301500---200035---4031第31頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五培養基高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌）操作P20

滅菌后培養基的存放：鍋內加水放入消毒桶裝入培養基蓋好鍋蓋接通電源加熱排盡鍋內冷空氣達到滅菌溫度時開始計時并保持足夠長的時間繼續加熱切斷電源壓力表指針歸零時打開鍋蓋取出培養基并存放好32第32頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五高壓蒸汽滅菌鍋安全使用注意事項：

①滅菌前外層鍋內要加入足夠的水,滅菌完成后要將鍋內的水排放干凈。②在滅菌過程中及滅菌后，壓力表壓力指針歸零之前,不能打開鍋蓋,以免發生危險。③注意日常維護和檢查,及時發現問題,及時修理，保證使用安全可靠。33第33頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五使用高壓蒸汽滅菌鍋進行物品滅菌時的注意事項：

①消毒鍋內放置的物品要有一定的縫隙，便于高溫蒸汽上下回流，達到良好滅菌效果。②鍋內冷空氣必須完全排盡，否則壓力表的指針雖然達到了規定的壓力，但由于鍋內冷空氣的存在，并不能達到相應的溫度，因而影響滅菌效果。③進行培養基滅菌時，鍋內達到規定的滅菌溫度后，在嚴格保持滅菌溫度的同時，還要嚴格保持滅菌時間。時間過長會破壞培養基內一些化學成分的有效性，時間過短則達不到滅菌效果。34第34頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

2.3.2.3無菌操作室內的滅菌方法熏蒸滅菌法射線滅菌法2.3.2.4外植體的表面滅菌P29化學消毒劑滅菌法抗生素抑菌法35第35頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

1.外植體滅菌的常用殺菌劑

良好的外植體滅菌效果的含義：外植體滅菌后無菌率高，同時植物細胞不會受損傷或只是輕微受損傷而能保持正常生長。

36第36頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.外植體表面滅菌外植體表面滅菌操作前的準備工作：①無菌水、漂洗瓶、切割用器皿（玻璃培養皿或不銹鋼切割盤）和金屬器具均經過高溫高壓滅菌并整齊擺放在超凈工作臺上。②滅菌劑配制好并整齊擺放在超凈工作臺上。37第37頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五38第38頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五外植體表面滅菌的一般過程預處理：外植體取材備用無菌水充分漂洗3～5次無菌條件下，消毒劑處理無菌條件下，70%酒精表面消毒30S～60S預處理39第39頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

3.影響外植體消毒效果的因素：

①消毒劑種類②消毒劑使用濃度③消毒處理時間

4.培養過程中污染原因及對策污染的病原類型污染發生原因防污染對策40第40頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

2.3.3外植體的接種

1定義

2外植體接種操作前的準備工作