實用標準文案實用標準文案文檔文檔實用標準文案文檔 國家自然科學基金申請書項目類別項目類別投送學科代碼1科學部編號CC03031102所在單位： 郵政編碼： 通訊地址： 電話： 傳真： 申請日期： 國家自然科學基金委員會

填報說明填寫申請書前，請先查閱國家自然科學基金有關項目申請辦法及規定。申請書各項內容，要實事求是，逐條認真填寫。表達要明確、嚴謹，字跡要清晰易辨。外來語要同時用原文和中文表達。第一次出現的縮寫詞，須注出全稱。申請書為十六開本，復印時用B5復印紙，于左側裝訂成冊。第三頁起各欄空格不夠時，請自行加頁。一式六份（至少一份為原件），由所在單位審查簽署意見后，按申報學科投送國家自然科學基金委員會對口科學部。地區科學基金項目，申請書另報送省（自治區）科委一份原件。封面上右上角“科學部編號”由對口科學部填寫，項目類別和申報學科代碼1由申請者填寫。申請者和項目組中具有高級專業技術職務的主要成員申請（含參加）的項目數，連同在研的國家自然科學基金項目數(不含重點項目、重大項目)，不得超過兩項。同一申請者研究內容相近的項目，只允許報送一個科學部。申請者可因同類項目競爭等原因,提出不宜評議本項目的專家名單（姓名與單位，3人以內）,附另頁于申請書原件中，供科學部選擇同行評議人時參考。科學部將對此信息保密。國家自然科學基金委員會通信地址:北京海淀區花園北路35號東門郵政編碼：100083

一、簡表 采用生物芯片技術,對人腺樣囊性癌的肺低轉 移細胞系及其高轉移克隆株進行大規模的基因表達定量對比分析,篩選鑒定肺高轉移相關抗 摘原基因,設計構建同源的核酸疫苗,建立動物模型,運用分子外科轉基因技術將核酸疫苗導入動物模型中,分析其抗腫瘤免疫效果,進一究 步闡明惡性腫瘤的肺轉移機理,尋找新的有效 研 內要靶位點,為防治癌轉移提供新方法。容主題詞1.主題詞數量不多于3個；2.主題詞之間空一格（英文用/分隔）和中文腫瘤轉移基因意英文tumor/metastasis/gene義簡表填寫要求簡表內容將輸入計算機，必須逐項認真填寫，采用國家公布的標準簡化漢字。簡表中所有代碼以最新發布的《國家自然科學基金申請項目分類目錄及代碼》為準填寫。高技術探索課題主題號按《高技術新概念新構思課題項目指南》中主題號填寫，申請其重點項目時項目類別也填寫B，并在申請書封面右上角加注“高技術探索課題重點項目”。凡選擇性欄目,將相應提示符A、B等之一填入該欄的右下角。部分欄目填寫要求：項目名稱──應確切反映研究內容和范圍,最多不能超過25個漢字(包括標點符號)。基礎研究──指以認識自然現象、探索自然規律為目的的,不直接考慮應用目標的研究活動。應用基礎研究──指有廣泛應用前景，但以獲取新原理、新技術、新方法為主要目的的研究。報審學科──申請項目所屬的最基礎學科。如涉及多學科可填寫兩個,先填為主學科。申請金額──以萬元為單位,用阿拉伯數字表示,注意小數點。起止年月──起始時間從申請的次年的1月算起。完成時間為完成年度的12月。所用的實驗室──系指研究項目將利用的實驗室,僅填寫國家計委批準的國家重點實驗室或部門批準的開放實驗室。所在單位名稱及代碼──按單位公章填寫全稱。例如“中國科學院西安光學精密機械研究所”不得填寫“中科院西安光機所”或“西安光機所”。全稱中的數字,一律寫中文，例如：航空航天工業部七O一研究所。首次申請國家自然科學基金的單位,尚未編入單位代碼,其代碼暫不填。參加單位數──指研究項目組成員所在單位數,包括主持單位和合作單位,以阿拉伯數字表示。項目組主要成員──指在項目組內對學術思想、技術路線的制定與理論分析及對項目的完成起主要作用的人員。本欄雙線右側內容不輸入計算機。研究內容和意義──摘要與主題詞均錄入軟盤。

二、立論依據(包括項目的研究意義、國內外研究現狀分析,并附主要的參考文獻及出處)對基礎研究，著重結合國際科學發展趨勢，論述項目的科學意義；對應用基礎研究，著重結合科學前沿，圍繞國民經濟和社會發展中的重要科技問題，論述其應用前景。項目的科學意義惡性腫瘤肺轉移的防治是臨床上進一步提高患者生存率和治愈率的關鍵所在，具備肺轉移潛能的癌細胞亞群是腫瘤組織與宿主組織之間長期相互作用、相互選擇的結果,在此過程中,這些癌細胞亞群產生了不同于其它亞群的特點,包括轉移相關基因及由其所決定的細胞和群體水平的特點,其中，肺高轉移相關抗原基因是一個相當重要的方面[1]，因而，篩選和鑒定肺高轉移相關抗原基因，有助于深入理解和闡明肺轉移的機制。在此基礎上，設計和構建有效的核酸疫苗，發展緊密結合臨床實際的轉染方法，激活機體的特異性主動免疫，必將對殺傷肺高轉移性癌細胞亞群，進而控制肺轉移有十分重要的意義。國內外研究現狀分析迄今為止,與口腔癌侵襲轉移相關的基因只局限在PC-erB-2nm23等少數幾個 53` `基因上[2],其根本原因在于以往的研究方法受到分子生物學技術的極大限制,只能研究單個或少數幾個基因。1996年,在人類基因組計劃的研究中，StevenFodor等[3]充分結合并靈活運用了計算機、DNA合成、探針雜交、照相平板印刷、激光共聚焦掃描等技術,創造了完整的DNA生物芯片,可同時定量檢測成千上萬個基因的表達譜,結合生物信息學可從整體上分析疾病。1998年，Gress等[4]采用含20,736個基因片段的DNA芯片,檢查了胰腺癌細胞株、胰腺癌組織與對照胰腺組織的基因表達譜,發現胰腺癌存在129個新基因序列和97個EST,從而找出了形成胰腺癌惡性表型的相關基因。現階段，國內已建立DNA生物芯片技術和人腺樣囊性癌細胞系ACC-2及其肺高轉移克隆株ACC-M[5]，我們采用含14，000個基因片段的DNA生物芯片首次對遺傳背景相同而生物學行為不同的ACC-2和ACC-M進行了大規模的基因表達定量對比分析，結果表明，低轉移性的ACC－2細胞系和肺高轉移性的ACC－M細胞株比較，有顯著差異的基因36個，有差異的基因213個。這些基因涉及跨膜蛋白、細胞信號傳導、細胞代謝過程等諸方面。其中的肺高轉移相關抗原基因可通過生物信息學分析、反義核酸、血小板凝集試驗和裸小鼠移植瘤肺轉移模型來篩選和鑒定。核酸疫苗集中了減毒疫苗和亞單位疫苗的優點,既可以不斷表達抗原蛋白,又可以克隆所需基因片段,以激發理想的免疫反應,國內外對以T細胞識別的腫瘤抗原為中心的抗腫瘤核酸疫苗免疫治療進行了大量的研究[8.9],表明能誘發機體的抗腫瘤免疫反應,殺傷癌細胞。但目前關于肺轉移相關抗原核酸疫苗的研究尚未見報道。本研究在篩選鑒定肺高轉移相關抗原基因的基礎上，設計構建同源的核酸疫苗，建立癌細胞動物模型，采用已建立的緊密結合臨床實際的分子外科轉基因方法，研究其抗腫瘤效果，將對深入理解肺轉移的機制和臨床外科治療模式的發展產生積極影響[10]。參考文獻1.Resser-JR;Carbone-DP.Immunotherapyofheadandneckcancer.Curr-Opin-Oncol.1998May;10(3):226-322Clayman-GL;Frank-DK;etalAdenovirus-mediatedwild-typep53genetransferasasurgicaladjuvantinadvancedheadandneckcancers.Clin-Cancer-Res.1999Jul;5(7):268-271Strachan.T,Abitbol.M,etal.Anewdimensionforthehumangenomeproject:towardscomprehensivemaps.NatureGenetic.1997,16;126-131GressTM,Muller-PillaschF,etal.Apancreaticcancer-specificexpressionprofile.Oncogene,1998,13:1819-18305.關曉峰,邱蔚六等.肺高轉移性腺樣囊性癌細胞株的篩選.中華口腔醫學雜志,1996;2:74-77.6.M.L.Disis,F.Mshiotaetbal.HumanHER-2/neuproteinimmunizationcircumventstolerancetoratneu:avaccinestrategyforselftumorantigens.Immunology.1998,93:192-199.7.Seder,RobertA.;Gurunathan,Sanjay.DNAVaccines:DesignerVaccinesforthe21stCenturyTheNewEnglandJournalofMedicine.1999;341(4):277-2798.CiernikIF,BerzofskyJAetal.InductionofcytotoxicTlymphocytesandantitumorimmunitywithDNAvaccinesexpressingsingleTcellepitops.JImmunol1996,156:2369-23759.GaryL.Clayman,AdelK.EI-naggaretalInvivomoleculartherapywithp53三、研究方案2.擬采用的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分析實驗方案和研究方法分別培養人腺樣囊性癌細胞系ACC-2及其肺高轉移克隆株ACC-M，抽提總RNA，分離mRNA，逆轉錄成cDNA并用P33標記.制備cDNA陣列膜片,包含約14,000個基因,每個基因的序列已測出,分別與標記的cDNA片段雜交,采用專用軟件和生物信息學分析基因表達量的差異。運用生物信息學的聚類分析、同源分析和各種基因庫信息對有差異的基因進行初步篩選,采用反義核酸技術,結合細胞學試驗、血小板凝集試驗和腺樣囊性癌裸小鼠移植瘤肺轉移模型,鑒定初步篩選的靶基因在細胞生長和轉移中的作用，通過RT-PCR和分子雜交進一步在臨床手術標本和其它口腔癌細胞系中確證。通過國際互聯網查詢美國國立衛生研究院(NIH)的生物信息科技中心(NCBI),可獲得與靶基因不同同源度的序列,據此選用含巨細胞病毒（CMV）啟動子和β-Gal基因的真核表達載體,設計構建與肺高轉移相關抗原基因同源的核酸疫苗。同時,查找含相同序列的鼠癌細胞系,并從中科院上海細胞所細胞庫中獲取相應的鼠癌細胞系,在小鼠（非裸鼠）上種植癌細胞建立癌細胞鼠模型。利用已建立的分子外科縫線和注射轉基因的方法,將核酸疫苗轉入癌細胞鼠模型中,通過荷瘤鼠模型的COX生存分析、T淋巴細胞亞群分析、抗β-Gal抗體測定來研究其體內抗腫瘤的效應,從中找出最有效的抗腫瘤作用因子.可行性分析1.本實驗室長期從事腺樣囊性癌肺轉移機理及其防治的研究,積累了豐富的理論知識和實驗經驗,并取得了公認的成就.2.已進行的預初試驗表明,肺低轉移性的ACC－2細胞系和肺高轉移性的ACC－M細胞株比較，已發現有顯著差異的基因36個，有差異的基因213個。3.申請者本人在攻讀研究生期間致力于腫瘤的分子外科和核酸疫苗的研究，該研究首次將含報告基因的質粒導入兔舌肌和胸鎖乳突肌，建立了分子外科轉基因技術。并已熟練掌握分子克隆和基因重組技術.3.本項目的創新之處1.首次采用DNA芯片對遺傳背景相同而生物學行為不同的口腔癌細胞進行大規模的基因定量對比分析。2.篩選和鑒定新的肺高轉移相關抗原基因.3.本研究設計構建了與肺高轉移相關抗原基因同源的核酸疫苗,深入研究了其抗腫瘤免疫作用.4.年度研究計劃及預期進展1.DNA芯片技術對低轉移性的ACC－2細胞系和肺高轉移性克隆株ACC－M細胞株的基因的大規模掃描分析.2.肺高轉移相關抗原基因篩選。肺高轉移相關抗原基因的分析和鑒定。1.構建核酸疫苗。1.建立癌細胞動物模型。2.測定分析抗腫瘤效應。5.預期研究成果1.獲得人腺樣囊性癌細胞系ACC-2及其肺高轉移性克隆株ACC-M二者完整的基因表達差異譜。2.口腔癌肺高轉移相關抗原基因的篩選和鑒定。3.核酸疫苗抗腫瘤方法的應用。4.在國內、外專業刊物上發表論文5-6篇,參加國際、國內會議交流2-3次。四、研究基礎1.與本項目有關的研究工作積累和已取得的研究工作成績1.與本項目有關的研究工作積累和已取得的研究工作成績12.預初實驗結果表明，肺低轉移性的ACC－2細胞系和肺高轉移性的ACC－M細胞株比較，有顯著差異的基因36個，有差異的基因213個。這些基因涉及細胞信號傳導、細胞代謝過程、跨膜蛋白等諸方面，為進一步進行肺高轉移相關抗原基因的篩選和鑒定及核酸疫苗的設計提供了寶貴的數據。3.申請者本人在攻讀研究生期間致力于腫瘤的分子外科和核酸疫苗的研究，該研究首次將含報告基因的質粒導入兔舌肌和胸鎖乳突肌中，建立了分子外科轉基因技術。并已熟練了掌握分子克隆和基因重組技術.2.已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑（包括利用國家重點實驗室和部2.已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑（包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃和落實情況）1.口腔腫瘤生物實驗室具備細胞生物學和分子生物學的各項有關設備,包括達到GFP標準的細胞培養室、進口培養箱、無菌標準操作臺、低溫超高速離心機、-80℃低溫冰箱、PCR擴增儀、核酸蛋白分析儀等。2.擁有DNA芯片分析的全套設備,包括96孔板和384孔板、PCR儀自動點膜儀、信號掃描儀、雜交爐等。3.建有達SPF標準的實驗動物中心。主要預初實驗結果1.DNA芯片對肺低轉移性的ACC－2細胞系和肺高轉移性克隆株ACC－M細胞的14,000個基因的定量對比掃描分析結果表明,有顯著差異的基因36個，有差異的基因213個。下面列出的是部分顯著差異基因的基因序列號及其相關信息。2.這些基因涉及細胞信號傳導、細胞代謝過程、跨膜蛋白等諸方面，為肺高轉移相關抗原基因的篩選和核酸疫苗的設計提供了可靠的數據和堅實的基礎。Hs.201967cds=(26,997)/gb=U05861/gi=487134/ug=Hs.201967/len=1222Hs.79748cds=(111,1700)/gb=AB018010/gi=5926733/ug=Hs.79748/len=1879Hs.183698cds=(29,508)/gb=Z49148/gi=793842/ug=Hs.183698/len=630Hs.111515gb=AA484881/gi=2213948/ug=Hs.111515/len=436Hs.78183cds=(51,1022)/gb=D17793/gi=457407/ug=Hs.78183/len=1204Hs.255772clone_end=5'/gb=AA186737/gi=1774854/ug=Hs.255772/len=511Hs.58593cds=(119,868)/gb=X16901/gi=35864/ug=Hs.58593/len=1408Hs.75069cds=(0,1451)/gb=U23143/gi=746435/ug=Hs.75069/len=1452Hs.150741clone_end=3'/gb=AW072071/gi=6027069/ug=Hs.150741/len=467Hs.109798cds=(41,421)/gb=AJ249732/gi=5921472/ug=Hs.109798/len=711Hs.14779clone_end=3'/gb=N64822/gi=1212651/ug=Hs.14779/len=636Hs.132390cds=(0,977)/gb=U09848/gi=495567/ug=Hs.132390/len=3505Hs.43800clone_end=5'/gb=W20128/gi=1295998/ug=Hs.43800/len=526Hs.241829clone_end=3'/gb=AI254779/gi=3862304/ug=Hs.241829/len=359Hs.71819clone_end=3'/gb=AI005336/gi=3214846/ug=Hs.71819/len=685Hs.189083clone_end=3'/gb=AA582554/gi=2359914/ug=Hs.1890833.3.申請者和項目組主要成員的學歷和研究工作簡歷，近期已發表與本項目有關的主要論著目錄*和獲得學術獎勵情況及在本項目中承擔的任務;青年科學基金申請者還應注明學位論文名稱及導師姓名與工作單位*論文：作者·題目·刊名·年份·卷（期）·頁碼專著：作者·書名·出版者·年份

五、經費預算支出科目支出科目金額（萬元）計算根據及理由1.合計16.002.科研業務費2.000.50辦公用品0.50學術交流及會議費用0.40科研成果鑒定0.40資料檢索、復印和論文打印、幻燈等0.20論文發表、版面、審稿費3.實驗材料費12.004.00分子生物學試劑4.00生化分析試劑1.00免疫分析試劑1.00普通試劑1.00基因庫查詢及軟件分析費1.00實驗動物4.儀器設備費1.001.00儀器設備添置費5.協作費0.50科研協作6.管理費0.50科研管理、水電費注：預算支出科目按下列順序填寫：1.科研業務費2.實驗材料費3.儀器設備費4.實驗室改裝費六、申請者正在承擔的其它研究項目(包括攀登計劃、863計劃、攻關任務和各部委、省市任務等項目的名稱及編號、任務來源、起止年月、負責或參加等情況)七、申請者承擔（負責或參加）國家自然科學基金資助項目的情況批準號批準號項目名稱起止年月負責或參加進展或完成情況

對申請者負責的前一個已結題科學基金資助項目（項目名稱及批準號）完成情況、后對申請者負責的前一個已結題科學基金資助項目（項目名稱及批準號）完成情況、后續研究進展及與本申請項目