第三章培養基及其配制

培養基是植物組織培養的重要基質。在離體培養條件下，不同種植物的組織對營養有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。因此，沒有一種培養基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養系統時，首先必須找到一合適的培養基，培養才有可能成功。第一節培養基成分及作用主要成分包括：無機鹽類（大量和微量元素）、維生素類、氨基酸類、有機附加物、植物生長調節物質、糖類，水和瓊脂等。

1.大量元素：指濃度大于0.5mmol／L的元素等。(1)N：是蛋白質、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在制備培養基時以NO3—N和NH4—N兩種形式供應。(2)P：是磷脂的主要成分。常用的物質有KH2P04或NaH2P04

(3)K：對碳水化合物合成、轉移、以及氮素代謝等有密切關系。制備培養基時，常以KCI、KN03等鹽類提供。(4)Mg、S和Ca、Mg：

是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質的組成成分。它們常以MgSO4·7H20提供。Ca是構成細胞壁的一種成分，Ca對細胞分裂、保護質膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2·2H2O提供。3.有機化合物⑴碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。蔗糖使用濃度在2%—3%，常用3%高壓滅菌時，一部分糖會發生分解，制定配方時要給予考慮。在大規模生產時，可用食用的綿白糖代替。

⑵維生素：這類化合物主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0.1—1.0mg／L。VB1對愈傷組織的產生和生活力有重要作用，VB6能促進根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發育有一定關系。Vc有防止組織變褐的作用。生長培養基是植物再生的必要條件蔗糖（0%）蔗糖含量（

1%）蔗糖含量（5%）外植體完全被綠色的芽所包裹，根生長在其下表面在外植體上既沒有芽發生，也沒有根和愈傷組織產生在外植體上表面邊緣產生芽，也有一些根發生芽從外植體的上表面發生而根從下表面發生tissuecultureintheAfricanViolet

(3)肌醇又叫環己六醇：在糖類的相互轉化中起重要作用。使用濃度一般為l00mg／L，適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。⑷氨基酸：是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。4.有機附加物：其對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明顯。其成分大多不清楚，所以一般應盡量避免使用。常用的有機附加物有:⑴椰乳：⑵香蕉：⑶水解酪蛋白：⑴IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小、，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。 ⑵NAA(萘乙酸)在組織培養中的起動能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。⑶IBA(吲哚丁酸)是促進發根能力較強的生長調節物質。⑷2，4—D(2，4—二氯苯氧乙酸)起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成，影響器官的發育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應。5.2細胞分裂素類細胞分裂素多用于誘導不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養時使用較少或用量較低。這類激素是腺嘌吟的衍生物，包括6－BA(6－芐基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激動素)、Zt(zeatin玉米素)等，細胞分裂素0.05－10mg／L。

其中Zt活性最強，但非常昂貴，常用的是6—BA。在培養基中添加細胞分裂素有三個作用：①誘導芽的分化促進側芽萌發生長。②促進細胞分裂與擴大。③抑制根的分化。5.3激素配比模式生長素與細胞分裂素：它們的比例決定著發育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進芽器官的分化，應除去或降低生長素的濃度，或者調整培養基中生長素與細胞分裂素的比例。高：有利于根的形成和愈傷組織的形成；適中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成生長素/細胞分裂素比例NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.

MSsaltsreducedto0.47g.l-1

SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1

Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.GA(赤霉素)：有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應等各有不同、培養基中添加的是GA3，主要用于促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發育成小植株；赤霉素和生長素協同作用，對形成層的分化有影響，當生長素／赤霉素比值高時有利于木質部分化，比值低時有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進器官或胚狀體的生長。6.抗生物質抗生物質有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5—20mg/L之間。添加抗生物質可防止菌類污染，減少培養中材料的損失。對于剛感染的組織材料，可向培養基中注入5%—10%的抗菌素。⑷活性炭在胚胎培養中也有一定作用，如在葡萄胚珠培養時向培養基加入0.1%的活性炭，可減少組織變褐和培養基變色，產生較少的愈傷組織。但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生長調節物質，這說明只需要極少量的活性炭就可以完全吸附培養基中的調節物質。大量的活性炭加入會削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂。很細的活性炭也易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動培養瓶?？傊?，那種隨意抓一撮活性炭放人培養基，會帶來不良的后果。因此，在使用時要有其量的意識，使活性炭發揮其積極作用。８、瓊脂瓊脂(agar)是固體培養基的必要成分，瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。通常所說的“煮化”培養基，就是使瓊脂溶解于90℃以上的熱水。瓊脂條的用量在6—10g／L之間，瓊脂粉的用量在3—4g／L之間。若濃度太高，培養基就會變得很硬，營養物質難以擴散到培養的組織中去。若濃度過低，凝固性不好。新買來的瓊脂最好先試一下它的凝固力。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。第二節培養基配制及注意事項（三）母液配制的藥品與器材1、藥品：配制MS培養基所需的藥品、生長調節物質、蒸餾水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL2、器材：各類天平、燒杯、容量瓶、量筒、母液瓶、標簽、冰箱等。（四）母液配制（以MS培養基為例）有機物母液鐵鹽母液無機大量母液無機微量母液激素母液配制MS培養基時母液的計算硼酸，硫酸銅，硫酸錳，硫酸鋅，氯化鈷，鉬酸鈉，碘化鉀托盤天平和電子天平2、無機微量母液（擴大100倍配1000ml）稱量工具成分3、鐵鹽（擴大100倍1000ml）鐵鹽硫酸亞鐵，Na2-EDTA注意：鐵鹽采用托盤天平稱取。鐵鹽選用硫酸亞鐵而不用硫酸鐵，是因為它溶解后易產生紅色的氫氧化鐵沉淀。6、母液的保存

(1)裝瓶:將配制好的母液分別倒入瓶中，貼好標簽，在標簽上注明母液名稱，配制倍數，與配制日期。

（2）儲藏：母液配好后放人冰箱內4℃低溫保存，用時再按比例稀釋。二、培養基的配制1、用具器材：粗天平、塑料量杯、燒杯、量筒、移液管、三角瓶、玻璃棒、藥勺、PH試紙（5.4-9.0）、橡皮吸球、吸水紙、羊皮紙等。2、藥品試劑：蒸餾水、蔗糖、瓊脂、1mol/LNaOH、1mol/LHCL、各種培養基母液（一）實驗用品（二）培養基配制（以1L百合繼代培養基為例）

1、培養基配方：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖+0.8%瓊脂2、配方成分計算：大量元素（擴大10倍配1L）微量元素（擴大100倍配1000ml）有機物