第六節

培養基的滅菌方法及原理問題1在發酵生產中，為什么要進行滅菌操作？P491、由于雜菌的污染，使生物反應中的培養物質因雜菌的消耗而損失，造成生產能力的下降；2、由于雜菌所產生的一些代謝產物，或在染菌后改變了培養液的某些理化特性，使產物的提取和分離變得困難，造成收率降低或使產品的質量下降；3、雜菌會大量繁殖，會改變反應介質的PH值，從而使生物反應發生異常變化；4、雜菌可能會分解產物，從而使生產過程失敗；5、發生噬菌體污染，微生物細胞被裂解，而使生產失敗，等等。1、培養基如何分類？在發酵生產中常用的固體還是液體培養基？2、說說培養基的六大營養要素？復習根據培養基的用途(特殊用途)不同，可將培養基分成：孢子\種子\發酵

增殖、選擇和鑒別培養基

根據培養基狀態不同，可將培養基分成：

固體、液體和半固體培養基

根據營養物質的來源不同，培養基可分為：

天然培養基、合成培養基和半合成培養基

現在是1頁\一共有41頁\編輯于星期三一、滅菌的方法

問題2為防止雜菌的污染，整個生化生產過程哪些需要注意滅菌？消毒與滅菌的區別？

消毒與滅菌在發酵工業中均有廣泛應用。消毒是指用物理或化學方法殺死物料、容器、器具內外的病源微生物。一般只能殺死營養細胞而不能殺死細菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和釀酒原汗等的巴氏消毒法，是將物料加熱至60℃維持30min，以殺死不耐高溫的物料中的微生物營養細胞。

滅菌是用物理或化學方法殺死或除去環境中所有微生物，包括營養細胞、細菌芽孢和孢子。

消毒不一定能達到滅菌要求，而滅菌則可達到消毒的目的。

培養基、發酵設備、空氣、菌種制作基本概念現在是2頁\一共有41頁\編輯于星期三控制有害微生物主要有以下幾種措施

現在是3頁\一共有41頁\編輯于星期三1、滅菌（sterilization）采用強烈的理化因素使任何物體內外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌，例如各種高溫滅菌措施等。滅菌實質上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細胞發生溶化、消失的現象。現在是4頁\一共有41頁\編輯于星期三現在是5頁\一共有41頁\編輯于星期三2、消毒（disinfection）從字義上來看，消毒就是消除毒害，這里的“毒害”就是指傳染源或致病菌的意思，英文中的“dis-infection”也是“消除傳染”的意思。所以，消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。現在是6頁\一共有41頁\編輯于星期三3、防腐（antisepsis）防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達到防止食品等發生霉腐的措施。（1）低溫（2）缺氧（3）干燥

（4）高滲

（5）高酸度

（6）防腐劑現在是7頁\一共有41頁\編輯于星期三4、化療（chemotherapy）化療即化學治療。它是利用具有高度選擇毒力（即對病原菌具有高度毒力而對宿主無顯著毒性）的化學物質來抑制宿主體內病原微生物的生長繁殖，借以達到治療該傳染病的一種措施。用于化療目的的化學物質稱化學治療劑。最重要的化學治療劑如各種抗生素、磺胺類藥物和中草藥中的有效成分等。

現在是8頁\一共有41頁\編輯于星期三1、化學試劑滅菌法化學試劑：甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等適用范圍：環境空氣、皮膚及器械的表面消毒2、射線滅菌法3、干熱滅菌法電磁波、紫外線或放射性物質適用范圍：無菌室、接種箱常用烘箱，滅菌條件為在160℃下保溫1h適用范圍：金屬或玻璃器皿現在是9頁\一共有41頁\編輯于星期三4、濕熱滅菌法利用飽和蒸汽進行滅菌、條件為：121℃，30min適用范圍：廣泛應用于生產設備及培養基的滅菌

例：高壓滅菌鍋5、過濾除菌法利用過濾方法阻留微生物適用范圍：制備無菌空氣6、火焰滅菌法火焰適用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口酒精燈現在是10頁\一共有41頁\編輯于星期三滅菌方法連線題接種針、試管口環境空氣、皮膚表面無菌室、接種箱培養基的滅菌空氣過濾除菌法火焰滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法化學試劑滅菌法比較各種微生物對熱的抵抗能力大小營養細胞、芽孢、病毒或孢子現在是11頁\一共有41頁\編輯于星期三二、濕熱滅菌原理濕熱滅菌原理P50滅菌條件滅菌不利方面由于蒸汽具有很強的穿透能力，而且在冷凝時會放出大量的冷凝熱(潛熱)，很容易使蛋白質凝固而殺死各種微生物。121℃，30min。同時也會破壞培養基中的營養成分，甚至會產生不利于菌體生長的物質。因為，在工業培養過程中，除了盡可能殺死培養基中的雜菌外，還要盡可能減少培養基中營養成分的損失現在是12頁\一共有41頁\編輯于星期三1、衡量熱滅菌指標P51

熱死時間：即在規定溫度下殺死一定比例的微生物所需要的時間。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時間：在此溫度下，殺死全部微生物所需要的時間。P51表3－15和3－16熱阻：對熱的抵抗力，指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。相對熱阻：幾種微生物對熱的相對抵抗能力。指微生物在某一特定條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。表3-17列出了某些微生物的相對熱阻。

滅菌方式大腸桿菌霉菌孢子細菌芽孢噬菌體或病毒干熱滅菌12-1010001濕熱滅菌12-103×1051-5苯酚11-21×10930甲醛12-102502紫外線15-1002-55-10現在是13頁\一共有41頁\編輯于星期三從表中可看出

芽孢或孢子的熱阻要比生長期營養細胞的熱阻大得多，這是由于芽孢或孢子內吡啶二羧酸含量對熱阻的增加有關。另外，芽孢子中蛋白質含水量較營養細胞低（特別是游離水分少），也是芽孢耐熱強的一個原因。圖3-3和圖3-4分別為大腸桿菌營養細胞和FS7954芽孢桿菌的芽孢在不同溫度下的死亡情況。

10t(min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-42468106058565410t(min)N/N0嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-4510152025121116110108105從表中可看出問題說說芽孢或孢子的熱阻要比營養細胞的熱阻大的原因？現在是14頁\一共有41頁\編輯于星期三比較熱阻大小營養細胞、芽孢、病毒或孢子說說工業化生產中廣泛使用濕熱滅菌法優缺點？問題現在是15頁\一共有41頁\編輯于星期三現在是16頁\一共有41頁\編輯于星期三受熱時間如何確定？在發酵工業中，對培養基和發酵設備的滅菌，廣泛使用濕熱滅菌法。工廠里，蒸汽比較容易獲得，控制操作條件方便，是一種簡單而又價廉、有效的滅菌方法。用濕熱滅菌的方法處理培養基，其加熱受熱時間與滅菌程度和營養成分的破壞都有關系。營養成分的減少將影響菌種的培養和產物的生成，所以滅菌程度和營養成分的破壞成為滅菌工作中的主要矛盾，恰當掌握加熱受熱時間是滅菌工作的關鍵。現在是17頁\一共有41頁\編輯于星期三2、微生物的死亡速率：對數殘留定律P52

微生物受熱死亡的原因，主要是因高溫使微生物體內的一些重要蛋白質，如酶等，發生凝固、變性，從而導致微生物無法生存而死亡。微生物受熱而喪失活力，但其物理性質不變。

在一定溫度下，微生物的受熱死亡遵照分子反應速度理論。在滅菌過程中，活菌數逐漸減少，其減少量隨殘留活菌數的減少而遞減，即微生物的死亡速率與任一瞬時殘存的活菌數成正比，

現在是18頁\一共有41頁\編輯于星期三式中，N—殘存的活菌數；t—滅菌時間（s）；K—滅菌速度常數（s-1），也稱反應速度常數或比死亡速度常數，此常數的大小與微生物的種類與加熱溫度有關；dN/dt—活菌數瞬時變化速率，即死亡速率。積分得：

式中：N0—開始滅菌（t=0）時原有活菌數；Nt----經時間t后殘存活菌數。微生物的死亡速率與任一瞬時殘存的活菌數成正比

上式是計算滅菌的基本公式，滅菌速度常數K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據。各種微生物在同樣的溫度下K值是不同的，K值愈小，則此微生物愈耐熱。現在是19頁\一共有41頁\編輯于星期三10t(min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-424681060嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線58565410t(min)N/N010-110-210-310-4510152025121116110108105從表中可看出問題在121度，枯草桿菌FS5230的K為0.047s-1，梭狀芽孢桿菌PA3679的K值為0.03s-1，請問哪一種微生物更耐熱？1）如微生物存在芽孢，其死亡速率呈現非對數死亡定律;2)培養液中油脂、糖類及一定濃度的蛋白質會增加微生物的耐熱性；高濃度鹽類、色素能削減其耐熱性;3）工程上，在進行滅菌的設計時，常認為N/N0=0.001，即在1000次滅菌中，允許有一次失敗;4)同一種微生物在不同的滅菌溫度下，k值不同，滅菌溫度愈低，k值愈小；溫度愈高，k值愈大。注：從上述的微生物對數死亡規律和非對數死亡動力學模型方程式可知，如果要達到徹底滅菌，即滅菌結束時殘留的活微生物數等于0，則滅菌所需的時間應為無限長，這在實際中是不可能的。現在是20頁\一共有41頁\編輯于星期三3、滅菌溫度和時間的選擇微生物的受熱死亡屬于單分子反應，其滅菌速率常數K與溫度之間的關系可用阿累尼烏斯公式表示：A---頻率常數，也稱阿累尼烏斯常數，s-1；R---氣體常數，8.314J/mol·K；T---絕對溫度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。K—滅菌速度常數（s-1），也稱反應速度常數或比死亡速度常數.上面說過，當培養基被加熱滅菌時，常會出現這樣的矛盾，這就是，加熱時，微生物固然會被殺死，但培養基中的有用成分也會隨之遭到破壞，那么有何良策可以既達到滅菌要求，同時又不破壞或盡可能少破壞培養基中的有用成分呢？實踐證明，在高壓加熱的情況下，培養基中的氨基酸和維生素極易被破壞，如在121℃，僅20min，就有59%的賴氨酸和精氨酸及其他堿性氨基酸被破壞，蛋氨酸和色氨酸也有相當數量被破壞。因此，必須選擇一個既能滿足滅菌需要，又可使培養基的破壞盡可能養活的滅菌工藝條件。現在是21頁\一共有41頁\編輯于星期三滅菌時，培養基成分分解速率常數K`與溫度之間的關系也可用阿累尼烏斯公式表示：K`---培養基內易被破壞成分的分解速率常數；A`---頻率常數，也稱阿累尼烏斯常數，s-1；R---氣體常數，8.314J/mol·K；T---絕對溫度，K；ΔE`---培養基成分分解所需活化能，J/mol。

當培養基成分從T1上升到T2時，微生物的死亡速率與培養基的分解有如下關系：從上式可知，K值的大小與微生物的種類與加熱溫度有關現在是22頁\一共有41頁\編輯于星期三通過實驗測定可知：

滅菌時殺死微生物的活化能大于培養基成分的破壞活化能值，因此：即隨著溫度的上升，微生物的死亡速率常數增加倍數要大于培養基成分的破壞速率的增加倍數。也就是說，結論1：當滅菌溫度上升時，微生物死亡速率的提高要超過培養基成分的破壞速率的增加。從上述的分析可知，在熱滅菌過程中，同時會發生微生物死亡和培養基破壞這兩種過程，且這兩種過程的進行速度都隨溫度的升高而加速，但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。據測定，每升高10℃時一般化學反應的反應速率的增加倍數是1.5-2.0，而殺死芽孢為5-10，殺死微生物細胞為35左右。。現在是23頁\一共有41頁\編輯于星期三

由此可見，若要減少營養成分的破壞，可升高溫度滅菌。結論2：在滅菌時選擇較高的溫度、較短的時間，這樣便既可達到需要的滅菌程度，同時又可減少營養物質的損失。

滅菌溫度℃滅菌時間（分）營養成分破壞量%10040099.31103667.01151550.0120427.01300.58.01450.082.01500.011.0

表3-21滅菌溫度、時間與營養成分破壞量的關系（N/No=0.001）

現在是24頁\一共有41頁\編輯于星期三問題滅菌要達到殺死99.99%的細菌芽孢，有兩種方法可以采用，一種是118℃滅菌15min，另一種是128℃滅菌5min。哪一種方法好，為什么？答：從理論研究和生產實踐都可證明，在滅菌過程中，同時會發生微生物死亡和培養基破壞這兩種過程，且這兩種過程的進行速度都隨溫度的升高而加速，但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。

因此，對于同一滅菌效果，選擇較高的溫度、較短的時間，這樣便既可達到需要的滅菌程度，同時又可減少營養物質的損失。現在是25頁\一共有41頁\編輯于星期三第七節培養基的濕熱滅菌方式及滅菌時間的計算1、間歇滅菌（分批滅菌、實消）P56定義：將配制好的培養基同時放在發酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養基和所用設備一起進行加熱滅菌的過程，通常也稱為實罐滅菌。（常用）24016012080時間（min)050100150溫度升溫冷卻保溫過程包括：升溫、保溫和冷卻等三個階段。

各階段對滅菌的貢獻：20%、75%、5%圖為培養基間歇滅菌過程中的溫度變化情況。1）基本概念一、培養基的濕熱滅菌方式現在是26頁\一共有41頁\編輯于星期三

在實際生產中，也可能遇到所供蒸汽不足、溫度不夠高的情況，這時可以適當延長滅菌時間。生產上甚至有用100℃蒸煮而達到徹底滅菌的實例。如要做固體曲而沒有高溫蒸汽時，可將原料用100蒸汽蒸30min，殺死其中的營養細胞，但孢子與細菌的芽孢沒有被殺死。將蒸過的原料置于室溫下過夜，未被殺死的孢子便發芽生長，芽孢發育成營養細胞，再30min便可殺死。如此連續反復進行2-3次，亦可達到徹底滅菌的目的。

從以上分析可知，滅菌過程中加熱和保溫階段的滅菌作用是主要的，而冷卻階段的滅菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不計。此外，還應指出的是，應當避免長時間的加熱階段，因為加熱時間過長，不僅破壞營養物質，而且也有可能引起培養液中某些有害物質的生成，從而影響培養過程的順利進行。問題

在實際生產中，如果遇到所供蒸汽不足，如何有用100℃蒸煮而達到徹底滅菌？家用土蒸鍋對食用菌三級種進行滅菌現在是27頁\一共有41頁\編輯于星期三2）間歇滅菌的操作間歇滅歇是在所用的發酵罐或其他培養裝置中進行的，它是在配制罐中配好培養基后，通過專用管道輸入發酵罐等培養設備中，然后開始滅菌。在進行培養基的間歇滅菌之前，通常先將發酵罐等培養裝置的分空氣過濾器進行滅菌，并且用空氣將分過濾器吹干。開始滅菌時，應先放去夾套或蛇管中的冷水，開啟排氣管閥，通過空氣管向發酵罐內的培養基通入蒸汽進行加熱，同時，也可在夾套內通蒸汽進行間接加熱。當培養基溫度升到70左右時，從取樣管和放料管向罐內通入蒸汽進一步加熱，當溫度升至120℃，罐壓為1*105Pa（表壓）時，打開接種、補料、消泡劑、酸、堿等管道閥門進行排汽，當然在保溫過程中，應注意凡在培養基液面下的各種進口管道都應通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道則應排放蒸汽，這樣才能不留死角，從而保證滅菌徹底。保溫結束后，依次關閉各排汽、進汽閥門，待罐內壓力低于空氣壓力后，向罐內通入無菌空氣，在夾套或蛇管中通冷水降溫，使培養基的溫度降到所需的溫度，進行下一步的發酵和培養。由于培養基的間歇滅菌不需要專門的滅菌設備，投資少，對設備要求簡單，對蒸汽的要求也比較低，且滅菌效果可靠，因此，間歇滅菌是中小型生產工廠經常采用的一種培養基滅菌方法。

現在是28頁\一共有41頁\編輯于星期三2、連續滅菌（連消）P57

1）定義：將配制好的培養基在向發酵罐等培養裝置輸送的同時進行加熱、保溫和冷卻而進行滅菌。左圖為連續滅菌過程中溫度的變化情況。由圖可以看出，連續滅菌時，培養基可在短時間內加熱到保溫溫度，并且能很快地被冷卻，因此可在比間歇滅菌更高的溫度下進行滅菌，而由于滅菌溫度很高，保溫時間就相應地可以很短，極有利于減少培養基中的營養物質的破壞。現在是29頁\一共有41頁\編輯于星期三發酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養基配料罐泵加熱塔維持罐冷卻管

連續滅菌的基本設備一般包括（1）配料預熱罐，將配制好的料液預熱到60-70，以避免連續滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產生水汽撞擊聲；（2）連消塔，連消塔的作用主要是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混和，并使料液的溫度很快升高到滅菌溫度（126-132）；（3）維持罐，連消塔加熱的時間很短，光靠這段時間的滅菌是不夠的，維持罐的作用是使料液在滅菌溫度下保持5-7min，以達到滅菌的目的；（4）冷卻管，從維持罐出來的料液要經過冷卻排管進行冷卻，生產上一般采用冷水噴淋冷卻，冷卻到40-50后，輸送到預先已經滅菌過的罐內。現在是30頁\一共有41頁\編輯于星期三噴射加熱連續滅菌流程滅菌介質原料介質蒸汽T=140度保溫段真空

流程中采用了蒸汽噴射器，它使培養液與高溫蒸汽直接接觸，從而在短時間內可將培養液急速升溫至預定的滅菌溫度然后在該溫度下維持一段時間滅菌，滅菌后的培養基通過一膨脹閥進入真空冷卻器急速冷卻，從圖中可以看出，由于該流程中培養基受熱時間短，營養物質的損失也就不很嚴重，同時該流程保證了培養基物料先進先出，避免了過熱或滅菌不徹底等現象。分別說出優點現在是31頁\一共有41頁\編輯于星期三薄板換熱器連續滅菌流程進料35℃100℃120℃維持罐120℃蒸汽147℃120℃55℃出料35℃水20℃31℃流程中采用了薄板換熱器作為培養液的加熱和冷卻器，蒸汽在薄板換熱器的加熱段使培養液的溫度升高，經維持段保溫一定時間后，培養基在薄板換熱器的冷卻段進行冷卻，從而使培養基的預熱、加熱滅菌及冷卻過程可在同一設備內完成。該流程的加熱和冷卻時間比噴射加熱連續滅菌流程要長些，但由于在培養基的預熱過程同時也起到了滅菌后培養基的冷卻，因而節約了蒸汽和冷卻水的用量。

分別說出優點現在是32頁\一共有41頁\編輯于星期三3、間歇滅菌與連續滅菌的比較

間歇滅菌或連續滅菌都有各自的優點和缺點，現比較如下：滅菌方式優點缺點連續滅菌1.

滅菌溫度高，可減少培養基中營養物質的損失2.

操作條件恒定，滅菌質量穩定3.

易于實現管道化和自控操作4.

避免了反復的加熱和冷卻，提高了熱的利用率5.

發酵設備利用率高1.

對設備的要求高，需另外設置加熱、冷卻裝置2.

操作較麻煩3.

染菌的機會較多4.

不適合于含大量固體物料的滅菌5.

對蒸汽的要求高間歇滅菌1.

設備要求低，不需另外設置加熱、冷卻裝置2.

操作要求低，適于手動操作3.

適合于小批量生產規模4.

適合于含有大量固體物質的培養基的滅菌1.

培養基的營養物質損失較多，滅菌后培養基的質量下降2.

需進行反復的加熱和冷卻，能耗較高3.

不適合于大規模生產過程的滅菌4.

發酵罐的利用率較低加熱器、維持罐（管）和冷卻器以及發酵罐等都應先進滅菌由表可見，無論在理論上或者在實踐上，與間歇滅菌過程相比，連續滅菌的優點十分明顯。因此，連續滅菌越來越多地被用培養基的滅菌。現在是33頁\一共有41頁\編輯于星期三二、滅菌時間計算與影響因素

A、分批滅菌（實罐滅菌）

一般可以不計升溫階段所殺滅的菌數，把培養基中所有的菌均看作是在保溫階段（滅菌溫度）被殺滅，這樣可以簡單地利用式5-4，粗略地求得滅菌所需的時間1、培養基滅菌時間的計算現在是34頁\一共有41頁\編輯于星期三例：有一發酵罐內裝40m3培養基，在121溫度下進行實罐滅菌。原污染程度為每1mL有2*105個耐熱細菌芽孢，121度時滅