干擾素生產工藝干擾素的生產工藝第1頁漢字名稱：干擾素英文名稱：interferon;IFN藥品類別：抗腫瘤藥，抗病毒藥所屬類別：生物反應調整劑干擾素的生產工藝第2頁干擾素介紹70年代中期人們發覺慢性乙型肝炎患者本身產生干擾素能力低下，在應用外源性干擾素后，不但產生了上述抗病毒作用，同時能夠增加肝細胞膜上人白細胞組織相容性抗原密度，促進T細胞溶解感染性肝細胞效能.干擾素的生產工藝第3頁現實狀況當前可供臨床選取干擾素種類很多。比如國產重組IFN－α1型和IFN－α2型，進口干擾能（IFN－α2b）、羅擾素（IFN－α2a）、惠福仁（類淋巴母細胞干擾素）及組合干擾素等等。干擾素的生產工藝第4頁類別各種亞型干擾素-α（含α1或α2或α2a或α2b）療效近似；干擾素-β（IFNβ）也有相同效果，但它在肌肉組織中易被滅活。干擾素-β制劑進入血液后，穩定性差，確切療效尚在觀察中，但可作為干擾素-α替換制劑。干擾素的生產工藝第5頁什么是干擾素（IFN）?干擾素是由病毒和其它種類干擾素誘導劑，經過刺激網狀內皮系統（人體免疫系統一個）、巨噬細胞、淋巴細胞以及體細胞所產生一個糖蛋白。這種蛋白含有各種生物活性，包含抗增殖、免疫調整、抗病毒和誘導分化作用。干擾素的生產工藝第6頁干擾素相對分子質量小，對熱穩定，4℃可保留很長時間，-20℃可長久保留其活性，56℃則被破壞，pH（酸堿度）2~10范圍內干擾素不被破壞。人體自然就能產生干擾素，經一定制劑加工過程也能制造成藥品-干擾素制劑。

干擾素的生產工藝第7頁藥理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，它普通為廣譜病毒抑制劑，對RNA和DNA病毒都有抑制作用。2.抑制細胞增殖。干擾素抑制細胞分裂活性有顯著選擇性，對腫瘤細胞活性比正常細胞大500～1000倍。干擾素抗腫瘤效果能夠是直接抑制腫瘤細胞增殖，或經過宿主機體免疫防御機制限制腫瘤生長。干擾素的生產工藝第8頁3．誘導細胞凋亡：干擾素能夠誘導腫瘤細胞凋亡，從而殺滅腫瘤細胞。4.干擾素對體液免疫、細胞免疫都有免疫調整作用，對巨噬細胞及NK細胞也有一定免疫增強作用。

干擾素的生產工藝第9頁作用機制:干擾素不能直接滅活病毒，而是經過誘導細胞合成抗病毒蛋白（AVP）發揮效應。干擾素首先作用于細胞干擾素受體，經信號轉導等一系列生休過程，激活細胞基因表示各種抗病毒蛋白，實現對病毒抑制作用。干擾素的生產工藝第10頁適應癥：1.用于各種惡性腫瘤，包含毛細胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期轉移性腎癌及胰腺惡性內分泌腫瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。2.與其它抗腫瘤藥品并用。3.作為放療、化療及手術輔助治療劑。4.病毒性疾病防治。干擾素的生產工藝第11頁不良反應：1.全身反應主要表現為流感樣癥狀，即寒戰、發燒和不適。2.骨髓抑制在用藥中可出現白細胞、血小板和網狀紅細胞降低。干擾素的生產工藝第12頁3.局部反應部分患者在注射部位可出現紅斑，并有壓痛，二十四小時后即可消退。4.其它脫發、皮疹、血沉加緊、嗜睡、一過性肝損傷。偶見過敏性休克，用藥前作過敏試驗。干擾素的生產工藝第13頁臨床上慣用干擾素有哪些制劑自然干擾素人體白細胞重組干擾素復合干擾素干擾素的生產工藝第14頁相關藥品國內生產企業1.α1b干擾素中國預防醫學科學院

衛生部長春生物制品研究所

衛生部上海生物制品研究所

深圳科興生物制品有限企業（賽若金）

2.人α2a干擾素衛生部長春生物制品研究所

廣州醫學院

沈陽三生制藥股份有限企業（因特芬）

海南新大洲藥業有限企業（貝爾芬）

浙江東陽市吳守聯合生物技術研究所

深圳科興生物制品有限企業

武漢天奧制藥有限企業（栓劑）干擾素的生產工藝第15頁3.人α2b干擾素長春生物制品研究所安徽安科生物高科技有限企業(安達芬)

麗珠集團蘇州新寶藥廠（隆化諾）

哈爾濱金亞哈爾濱生物制品有限企業（利能）

上海華新生物高技術有限企業

天津華立達生物工程企業

蘇州新良藥廠

4.人γ干擾素上海生物化學研究所

中國預防醫學科學院

衛生部上海生物制品研究所

第二軍醫大學

上海克隆生物高技術有限企業

珠海麗珠制藥有限企業

干擾素的生產工藝第16頁干擾素生產工藝路線:路線1：體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFNα-n3/Alferon，同意上市產量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細胞起源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴潛在血源性病毒污染可能性干擾素的生產工藝第17頁路線2：人源轉化細胞系培養生產工藝：1999年：IFNα-n1/Wellferon,同意用于臨床。優點：首次實現大規模商業化生產。缺點：活性低，退出臨床應用。干擾素的生產工藝第18頁路線3：基因工程大腸桿菌發酵生產工藝:上市產品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；－：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表示產物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發酵過程，隨即變性、復性過程。干擾素的生產工藝第19頁路線4：動物無限細胞系培養生產工藝：上市產品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；，Rebif(Serono)表示產物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點：分泌表示，產量低，成本高,過程嚴格干擾素的生產工藝第20頁路線5：基因工程假單胞桿菌發酵生產工藝：宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）上市產品：IFNα-2b/安福隆表示產物：無糖基化可溶性蛋白質，含有天然分子結構和生物活性工藝特點：發酵周期短：幾個小時無需變性、復性過程，取得有活性產品純化過程：淘汰抗體親和層析干擾素的生產工藝第21頁基因工程假單胞桿菌構建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立：第一步：干擾素α-2b基因克隆第二步：表示載體構建第三步：工程菌構建干擾素的生產工藝第22頁第一步：干擾素α-2b基因克隆制備白細胞，病毒誘導，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質粒,轉化E.coli,篩選判定克隆。測序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。干擾素的生產工藝第23頁第二步：表示載體構建IFN基因與表示載體連接轉化大腸桿菌篩選陽性克隆取得序列正確表示載體干擾素的生產工藝第24頁第三步：工程菌構建轉化假單胞桿篩選高表示、穩定遺傳工程菌取得原始菌種干擾素的生產工藝第25頁菌種庫建立與保藏QC：菌種特征、生產能力、質粒穩定性菌種檢驗合格后，方可投產。干擾素的生產工藝第26頁干擾素α-2b發酵工藝過程干擾素的生產工藝第27頁搖瓶培養：取保留工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測：OD值和發酵液雜菌檢驗。干擾素的生產工藝第28頁種子罐培養：接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養：30℃，pH7.0。控制：級聯調整通氣量和攪拌轉速檢測：顯微鏡和LB培養基劃線檢驗，控制雜菌。干擾素的生產工藝第29頁發酵罐培養：接種：通入300L培養基發酵罐，接種量10%。控制：級聯調整通氣量和攪拌轉速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點控制：OD值達9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測：發酵液雜菌檢驗干擾素的生產工藝第30頁菌體搜集：連續流離心機：冷卻發酵液，16000r/min離心搜集。菌體保留：－20℃冰柜，不超出12個月。檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質粒結構一致性、質粒穩定性。干擾素的生產工藝第31頁干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解預處理離心初級分離干擾素的生產工藝第32頁1.菌體裂解：裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF。破碎－20℃菌體：2厘米以下碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。干擾素的生產工藝第33頁2.預處理-沉淀：加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。干擾素的生產工藝第34頁3.離心：連續流離心機：2℃～10℃，16000r/min搜集上清液：含有重組干擾素蛋白質雜質沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。干擾素的生產工藝第35頁4.初級分離：鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續流離心機，16000r/min保留：搜集沉淀，粗干擾素，4℃保留。干擾素的生產工藝第36頁干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝干擾素的生產工藝第37頁1.溶解粗干擾素配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統，百級層流下搜集。冷卻至2℃～10℃。檢驗:緩沖液pH值和電導值。溶解：2℃～10℃，勻漿，完全溶解。干擾素的生產工藝第38頁2.沉淀與疏水層析等電點沉淀（1）：磷酸調整至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心搜集上清液。疏水層析：洗脫與搜集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。等電點沉淀（2）：磷酸調整pH4.5，調整電導值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過夜干擾素的生產工藝第39頁超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調整溶液pH8.0，電導值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。干擾素的生產工藝第40頁4.陽離子交換層析與濃縮用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進行洗脫配合SDS搜集干擾素峰。濃縮：10ku超濾膜進行。干擾素的生產工藝第41頁5.凝膠過濾層析洗滌液：0.15MNaCl0.01