（優選）細菌耐藥機制當前1頁，總共81頁。當前2頁，總共81頁。當前3頁，總共81頁。一、外膜孔蛋白減少或丟失細胞內抗生素濃度降低膜孔蛋白(OprD):

當前4頁，總共81頁。細胞外膜上的某些特殊蛋白是一種非特異性的、跨越細胞膜的水溶性物質擴散通道。膜孔蛋白當前5頁，總共81頁。革蘭陰性細菌細胞膜當前6頁，總共81頁。某些細菌本身存在的膜孔蛋白較少或蛋白通道較小，使一些抗菌藥物不能進入菌體內部，稱為“內在性耐藥”或“固有性耐藥”（intrinsicallyresistant），即這種耐藥并非是由于任何染色體的突變或是耐藥質粒的獲得所致。如銅綠假單胞菌的細胞外膜上沒有大多數革蘭陰性細菌所具有的典型的高滲透性孔蛋白，它的孔蛋白通道對小分子物質的滲透速度僅為典型孔蛋白通道的1%。

“先天不足”當前7頁，總共81頁。一些具有高滲透性外膜且對抗菌藥物敏感的細菌可以通過降低外膜的滲透性而發展成為耐藥菌，即原有的孔蛋白通道由于細菌發生突變而使該孔蛋白通道關閉或消失，則細菌就會對該抗菌藥物產生很高的耐藥性。亞胺培南是一種非典型的β-內酰胺類抗菌藥物，主要是通過一個特殊的孔蛋白通道OprD2的擴散進入細菌的，一旦這一孔蛋白通道消失，則產生耐藥性?！昂筇飓@得”當前8頁，總共81頁。產氣腸桿菌從亞胺培能敏感株變為耐藥株當前9頁，總共81頁。亞胺培南敏感及耐藥的產氣腸桿菌PFGE圖C1C2:亞胺培南敏感C3C4:亞胺培南耐藥當前10頁，總共81頁。亞胺培南敏感及耐藥的產氣腸桿菌SDS圖C1C2:亞胺培南敏感C3C4:亞胺培南耐藥當前11頁，總共81頁。PCR擴增Omp36全長及序列分析IS90398%（約1000bp)當前12頁，總共81頁。插入序列引起OprD2缺失（銅綠）ISPa1328約2000bpOprD2當前13頁，總共81頁。細菌產生一種或多種水解酶或鈍化酶來水解或修飾進入細胞內的抗菌藥物，使之到達靶位之前失去活性細菌產生的滅活酶主要有：

β-內酰胺酶氨基糖苷類鈍化酶氯霉素乙酰轉移酶

MLS鈍化酶二、產生滅活酶當前14頁，總共81頁。超廣譜-內酰胺酶（ESBLs）高產AmpC酶碳青霉烯酶最主要的耐藥因素對-內酰胺抗生素造成威脅-內酰胺酶臨床上最重要的-內酰胺酶當前15頁，總共81頁。是質粒介導的能夠水解頭孢他啶、頭孢噻肟等亞氨基β-內酰胺類及氨曲南等單環酰胺類抗生素，并可被克拉維酸等β-內酰胺酶抑制劑所抑制的一類β-內酰胺酶。ESBLs在分子生物學分類中屬于A類酶，在Bush分類中屬于2be類酶。超廣譜-內酰胺酶（extended-spectrum-lactamases，ESBLs）當前16頁，總共81頁。ESBLs的分類根據基因同源性不同分為：TEM型80SHV型46CTX-M型37OXA型18其它型20.CTX-M-1組CTX-M-2組CTX-M-8組CTX-M-9組當前17頁，總共81頁。中國400株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型分布當前18頁，總共81頁。32家醫院1994-2003年

大腸桿菌及肺炎克雷伯菌產ESBLs百分率當前19頁，總共81頁。頭孢菌素酶

大部分腸桿菌科細菌如腸桿菌屬菌種、弗勞地枸櫞酸桿菌、摩根摩根菌、普魯菲登菌屬菌種粘質沙雷菌等都能產生染色體介導的AmpC酶。當前20頁，總共81頁。

陰溝腸桿菌當前21頁，總共81頁。ACT-1,DHA-1,CMY(Peking)DHA-1,CIT,ACT-1(Shanghai)

DHA-1(Zhejiang)DHA-1,ACT-1(GuangZhou)DHA-1isThePredominantTypeinChinaMapofChina當前22頁，總共81頁?？寺∑蜳CR產物1100bp共6432bp

ORF1ORF2ORF3ORF4ORF5ORF6IS26orf-1

DHA-1ampRqacE⊿1sul15232bp當前23頁，總共81頁。指所有能明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類β內酰胺酶分別屬于Ambler分子分類中的A類、B類、D類酶。碳青霉烯酶

當前24頁，總共81頁。天然來源碳青霉烯酶嗜麥芽寡養單胞菌的L1酶獲得性碳青霉烯酶（Ambler分子分類）B類酶（金屬酶）：IMP、VIM類及SPM-1A類酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等D類酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其來源可分為當前25頁，總共81頁。金屬酶染色體編碼的金屬酶：BCⅡ，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多來源于環境寄生菌。獲得性金屬酶：IMPVIMSPMGIM-1SIM-1，位于可轉移的基因元件上，造成區域性傳播。當前26頁，總共81頁。IMP型金屬酶IMP型金屬酶GenBank上已公布21種，比較它們相互之間的序列表明：IMP型金屬酶大致可以分為兩組：1）IMP-1、IMP3-7、IMP9－11、IMP-162）IMP-2和IMP-8、12、13、19、20當前27頁，總共81頁。中國IMP-42001年香港鮑曼2001年廣州楊格枸櫞酸桿菌、銅綠IMP-12004年12月江蘇無錫銅綠IMP-82001臺灣銅綠當前28頁，總共81頁。VIM型金屬酶VIM型金屬酶與IMP類金屬酶同源性40％，但兩類金屬酶的動力學性質相似，編碼基因都位于整合子上。目前VIM型金屬酶GenBank上已公布12種，比較它們相互之間的序列可將VIM金屬酶大致分為三組：1）VIM-1、4、5、11a2）VIM-2、3、6、8、9、10、11b3）VIM-7當前29頁，總共81頁。VIM型金屬酶分布VIM-11999年意大利

銅綠氧化木糖產堿桿菌惡臭假單胞

2003－2004希臘

大腸肺克

法國肺克VIM-22000法國

銅綠

意大利希臘日本韓國葡萄牙西班牙波蘭克羅地亞智利阿根廷美國中國VIM-32001年臺灣地區

銅綠VIM-42002年希臘

銅綠

2003瑞典

銅綠2004意大利

肺克陰溝

2004波蘭銅綠當前30頁，總共81頁。VIM-52004土耳其肺克銅綠VIM-62004新加坡惡臭假單胞VIM-72004美國銅綠VIM-8哥倫比亞銅綠VIM-9，10英國VIM-11阿根廷意大利VIM型金屬酶分布當前31頁，總共81頁。亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌金屬酶檢測結果北京（27）上海（32）杭州（27）廣州（32）成都（22）金屬酶表型陽性菌株數35310百分率11.1％15.6％11.1％3.1％0.0％金屬酶基因型陽性菌株數36410百分率11.1％18.8％14.8％3.1％0.0％當前32頁，總共81頁。

VIM-2基因整合子結構圖A：B2，B3，B28，H19，H26，H54，G4結構同In72B：S5，S9，S10，S11，S12（S15、H22除外）

intI1attI1aacA459-bVIM-259-beaadB59-be3’-CS

intI1attI1aacA459-beVIM-259-be3’-CSAB當前33頁，總共81頁。H22H26g4s5s9s10s11s12s15b2b3b28w19w54Marker50kbABH22H26g4s5s9s10s11s12s15b2b3b28w19w54MarkerPFGE譜分析結果：共有七種類型，來自上海的六株為同一類型，來自北京的三株分兩個類型，來自杭州的四株同樣也分兩個類型。各地區之間的類型各不相同。反復嘗試通過接合試驗及質粒抽提物電轉化傳遞金屬酶基因均未獲成功。經XbaI內切酶消化的染色體PFGE與VIM-2探針雜交顯示其中10株銅綠假單胞菌50-kb大小的酶切片段雜交陽性，而其余3株（H22、H26、B2）沒有陽性片段。當前34頁，總共81頁。Ａ類酶包括陰溝腸桿菌、粘質沙雷菌中由染色體介導的NMC-A、Sme-1～Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中質粒介導的KPC-1-4酶、銅綠假單胞菌中質粒介導的GES-2酶。碳青霉烯類抗生素水解酶當前35頁，總共81頁。二株產IMI-1陰溝腸桿菌PFGE結果當前36頁，總共81頁。AntibioticsMIC(mg/l)EcloacaeEC600

E.coliC600E8

E.coliDH5E.colipT103Imipenem≥320.38≥320.25≥32Ciprofloxacin0.0640.250.250.006008Amikacin4220.250.38Cefepime20.0640.0640.1250.047Ceftazidime160.50.380.50.25Cefotaxime120.050.1250.0940.047Cefoperazone≥2560.51.50.0474Cefoperazone/Sulbactam1280.25262Piperacillin/Tazobactam≥2562424Ticarcilliin/ClavulanicAcid≥2561232432Ampicillin/Sulbactam≥2568641.5NDEcloacae8,EC600,E.coliC600E8，E.colipT103和E.coliDH5對抗菌藥物的體外抗菌活性當前37頁，總共81頁。陰溝腸桿菌、接合菌質粒電泳圖譜

M1ABM2

54kb15kb當前38頁，總共81頁。SchematicrepresentationoftheclonedE.coRⅠfragment

IS903IMI-2Imi-2RIS903IS2903bp921bp882bp876bp921bp10629bp(GenBankaccessionnumber:AY780889)Imi-R與ImiR同源性為97%。IMI-2與IMI-1同源性99%，僅在37位由天冬氨酸→天冬酰胺，106位由組氨酸→酪氨酸

當前39頁，總共81頁。抗菌藥物肺炎克雷伯菌亞胺培南>32亞胺培南/克拉維酸16美羅培南>32美羅培南/克拉維酸16厄他培南>256頭孢他啶>256頭孢他啶/克拉維酸>256頭孢噻肟>256頭孢噻肟/克拉維酸>256頭孢吡肟>256頭孢曲松>256頭孢西丁>256氨曲南>256頭孢哌酮/舒巴坦>256哌拉西林/三唑巴坦>256環丙沙星>32阿米卡星>256多重耐藥肺炎克雷伯菌當前40頁，總共81頁。轉化試驗抽提亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌質粒轉化DH5α，在含1g/ml的亞胺培南的MH平板上篩選成功篩選到亞胺培南耐藥的轉化菌（轉化質粒約60kb）染色體帶61kb當前41頁，總共81頁。PCRPCR篩選β內酰胺酶耐藥基因包括TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM、OXA-10和KPC-1以肺炎克雷伯菌質粒DNA為模板PCR陽性為TEM、SHV和KPC轉化菌和克隆菌只有KPC陽性PCR產物測序分別為TEM-1、SHV-12和KPC-2當前42頁，總共81頁。轉化菌質粒（亞胺培南耐藥基因克隆）EcoR?,HindⅢ，Nhe?等酶切Nhe?pTeasyVectorpTeasyVector1.5kb在含亞胺培南1g/mlMH平板篩選當前43頁，總共81頁?？寺∑螠y序對重組質粒的插入片段進行步移測序，獲得1554bp核苷酸DNAssist軟件分析，1個開放讀碼框(ORF)經GenBankBlast程序分析，該ORF與KPC-2(

GenBank注冊號:AY210886)

的核苷酸序列同源性為100%當前44頁，總共81頁。D類酶（OXA酶）在Bush分群中屬于2d類，對苯唑西林的水解活性很強。OXA型碳青霉烯酶對亞胺培南的水解活性較低，對頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉維酸抑制。OXA型碳青霉烯酶編碼基因可位于質?；蛉旧w上，或定位在I型整合子基因盒中，具備向其他菌種轉移的能力碳青霉烯類抗生素水解酶當前45頁，總共81頁。blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我國鮑曼不動桿菌最主要的碳青霉烯酶，

ISAba1與OXA基因的表達和轉移密切相關342株亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌中339株檢測到至少一種OXA基因，303株檢測到OXA-23-like和OXA-51-like基因，22株只檢測到OXA-23-like基因，17株只檢測到OXA-51-like基因；其中在313株菌株的OXA-23-like基因上游34bp處檢測到ISAba1，在13株菌株的OXA-51-like基因上游7bp處檢測到ISAba1。當前46頁，總共81頁。氨基糖苷類鈍化酶分為：磷酸轉移酶（APH）乙酰轉移酶（AAC）核苷轉移酶（ANT）氨基糖苷類鈍化酶作用機制：

三者分別使抗生素的羥基磷酸化、氨基乙?；土u基核苷化，使之不能再與細菌核糖體結合。氨基糖苷類耐藥當前47頁，總共81頁。慶大霉素高水平耐藥（HLGR）主要的耐藥機制

氨基糖苷類修飾酶耐藥基因百分率

AAC(6’)-Ie-APH(2’)-Iaaac(6’)-Ie-aph(2’)-Ia＞90%

APH(2’)-Icaph(2’)-IcAPH(2’)-Idaph(2’)-IdAPH(2’)-Ibaph(2’)-Ib＜10%氨基糖苷類耐藥當前48頁，總共81頁。8,724bpORF1ORF2ORF4

ORF35’3’ISEcp1(tnpA)

aph-Ie

repD

str部分序列

一種新的質粒介導的腸球菌氨基糖苷類耐藥基因aph(2”)-Ie當前49頁，總共81頁。三、靶位改變當前50頁，總共81頁。主要抗菌藥物作用靶位-內酰胺類青霉素結合蛋白（PBP）氨基糖苷類核糖體30S亞基大環內酯類核糖體50S亞基氟喹諾酮類DNA旋轉酶（拓撲異構酶Ⅱ）、拓撲異構酶Ⅳ糖肽類D-丙氨酰D-丙氨酸四環素類核糖體50S亞基

當前51頁，總共81頁。PBP2a的作用PBP2a與β-內酰胺抗生素親和力低，替代正常PBP功能

87Kda——PBP1——80——PBP2——

78——PBP2a75——PBP3’——70——PBP3——41——PBP4——當前52頁，總共81頁。當前53頁，總共81頁。當前54頁，總共81頁。DRIRIRDRSCCmecccrAccrBmecImecR1mecAorfXJ1J3J2SCCmec當前55頁，總共81頁。當前56頁，總共81頁。I－V型當前57頁，總共81頁。VSHA-MRSACA-MRSA

高耐藥性較低

陰性

PVL陽性I、II、IIISCCmecIV、V當前58頁，總共81頁。金葡菌耐藥性的發展歷程S.aureusPenicillin-resistantS.aureusMethicillin-resistantS.aureus(MRSA)PenicillinMethicillinVancomycin-resistantenterococcus(VRE)Vancomycin(glycopeptide)-Intermediate-ResistantS.Aureus（VISA、GISA）Vancomycin-ResistantS.Aureus（VRSA）Vancomycin[1940][1960s][1990s][1996]Superbugs[2002]當前59頁，總共81頁。氟喹喏酮的耐藥機理拓撲異構酶IV(parC,parE)拓撲異構酶II(gyrA,gyrB)左氧氟沙星氟喹喏酮當前60頁，總共81頁。糖肽類抗生素包括萬古霉素、替考拉寧等，是高分子量的疏水性化合物。主要耐藥機制：VRE的細胞壁肽糖前體末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸發生了改變，萬古霉素不能與之相結合，因此不能抑制VRE的細胞壁合成。耐萬古霉素的腸球菌（VRE）當前61頁，總共81頁。transposaseresolvasevanRvanSvanHvanAvanX6590bp(ZY02,HS3)表示PCR擴增vanYvanZ10Kb（ZY01）轉座功能（轉座酶transposase基因和解離酶revolsase基因，分別編碼產生轉座酶和解離酶在轉座過程中發揮作用）調控耐藥基因（VanR和VanS）產生耐糖肽類的縮肽（VanH脫氫酶、VanA連接酶和VanX二肽酶）輔助蛋白（VanY和VanZ）含VanA基因簇的轉座子轉座入各種質粒，或通過接合轉座導致VRE耐藥性的傳播

當前62頁，總共81頁。大環內酯類的耐藥機制核糖體靶位點的改變:erm編碼，高耐;法國、西班牙、中國主動外排泵:

mef

編碼，低耐

，加拿大、美國、修飾酶當前63頁，總共81頁。16SrRNA甲基化酶氨基糖苷類抗生素作用位點：細菌16SrRNA以往認為最重要的氨基糖苷類抗生素耐藥機制：修飾酶，作用位點在藥物，引起一種或幾種藥物耐藥2002最新發現一類新的氨基糖苷類抗生素耐藥機制：16SrRNA甲基化酶，引起藥物作用位點的甲基化，導致細菌對所有氨基糖苷類抗生素高水平耐藥，目前發現4種：armA、rmtA、rmtB、rmtC多重耐藥鮑曼不動桿菌在我國各省市廣泛流行，該菌對氨基糖苷類抗生素耐藥率和耐藥水平高16SrRNA甲基化酶是否在介導該菌對氨基糖苷類抗生素耐藥中發揮作用需要系統研究當前64頁，總共81頁。700株鮑曼不動桿菌對5種氨基糖苷類

抗生素體外抗菌活性·5種氨基糖苷類抗生素耐藥率均大于60％；·377株（53.9％）菌株對5種氨基糖苷類抗生素均耐藥；·334株（47.7％）菌株armA陽性；·armA陽性菌株對上述所有氨基糖苷類抗生素均高水平耐藥,MIC＞256mg/L

·反復進行接合實驗、質粒抽提、電轉化均未成功·Southern-blot雜交證實armA基因位于克隆A、B、C約220kb、300kb、220kb大小的染色體ApaI酶切條帶上armA基因定位于鮑曼不動桿菌染色體當前65頁，總共81頁。四、主動外運

有些抗菌藥物（常見的如四環素類及喹諾酮類）能誘導細菌的主動外運，抗菌藥物難以在細菌內積累到有效濃度，造成對抗菌藥物耐藥程度的普遍提高。當前66頁，總共81頁。外排泵的結構外排系統由3個部分組成：位于內膜的腫瘤耐藥分化家族(resistant—nodulation—divisionfamily，RND)的質膜轉運體內外膜之間的膜周連接蛋白或膜融合蛋白(MFP)位于外膜的孔道形成蛋白(0EP)

當前67頁，總共81頁。組間外排泵表達量均值比較當前68頁，總共81頁。

是指細菌粘附于固體或有機腔道表面，形成微菌落，并分泌細胞外多糖蛋白復合物將自身包裹其中而形成的膜狀物。其生化組成為藻酸鹽多糖和蛋白復合物。菌膜可阻止巨噬細胞、抗體、藥物作用于菌體五、細菌生物被膜（Biofilm）當前69頁，總共81頁。生物被膜當前70頁，總共81頁。細菌形成生物被膜后，往往對抗菌藥物產生高度耐藥性，原因有細菌生物被膜可減少抗菌藥物滲透吸附抗菌藥物鈍化酶，促進抗菌藥物水解細菌生物被膜下細菌代謝低下，對抗菌藥物不敏感生物被膜的存在阻止了機體對細菌的免疫力，產生免疫逃逸現象，減弱機體免疫力與抗菌藥物的協同殺菌作用當前71頁，總共81頁。其他耐藥機制缺乏自溶酶替代途徑酶的過量產生等靶位保護機制當前72頁，總共81頁。質粒介導的喹喏酮耐藥

1998年等從一株肺炎克雷伯菌（UAB1）中發現能介導多種抗生素耐藥的質粒pMG252，經接合傳遞后其接合子對環丙沙星的耐藥性增加近30倍(MIC0.008→0.25μg/mL)。

在該質粒內發現了喹諾酮耐藥（quinoloneresistance）基因，命名為qnr

(Lancet1998;351:797–99)

當前73頁，總共81頁。作用機制保護DNA旋轉酶Qnr通過與旋轉酶特異地結合從而影響酶的內在活性,降低了酶與DNA的結合,導致喹諾酮類藥物的作用靶位數量減少Qnr與旋轉酶的結合,改變了藥物結合區域的構象,從而降低了藥物識別靶位的效率保護拓撲異構酶Ⅳ細菌對拓撲異構酶Ⅳ的保護作用與DNA旋轉酶類似Hegde,S.S.etal.Science308:1480,2005QnrDNA旋轉酶當前74頁，總共81頁。表5株qnrA陽性大腸埃希菌及其接合菌的MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP63128256643225616212>256Tc631410.5>2564414>256140642566432322888>256Tc1401421162884>256142484162564424>256Tc1420.50.511322882>256Z8161616321284256>256>256>256TcZ80.060.060.1250.06128464>256>256>256Z11326416321284256>256>256>256TcZ110.060.060.1250.0664464>256>256>256J530.0150.1250.1250.030.060.1254112J53為受體菌當前75頁，總共81頁。表38株qnrA陽性肺炎克雷伯菌及其接合菌的MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP14-264128＞64128322111>256Tc14-20.250.510.25162221>2562564256643225616422>256Tc2518121284414>256316425612812825616212>256Tc311812>2568412>2569628221282428>256Tc9618122568414>25615181684644428>256Tc1511110.25321212>256152864441282428>256Tc1520.520.50.5641414>25615332128161632>64>256>256>256>256Tc1530.5112161212>2561564821644428>256Tc1562820.25644414>256J530.0150.1250.1250.030.060.1254112當前76頁，總共81頁。質粒DNA與PCR產物