天然藥物提取工藝糖類提取工藝第1頁/共80頁第四章糖類提取工藝第2頁/共80頁基本要求

了解碳水化合物/糖的概念和知識，糖的分類，多糖的各種生理活性；熟悉糖類的性質和鑒定方法，掌握糖類的提取方法和分離。熟悉多糖純度檢驗和結構分析。實例

第3頁/共80頁第一節概述糖類不僅是生物體內的貯藏養料，而且是生物合成其他有機化合物的前體。作為一種細胞分子表面“識別標志”，參與體內生理和病理過程；21世紀對多細胞生物高層次生命現象研究的重要內容之一。第4頁/共80頁第一節概述糖類又稱為碳水化合物(carbohydrates)一般由碳、氫、氧三種元素構成，而且分子中氫與氧的原子數之比為2:1，與水(H2O)中比例相同，糖類物質的分子式通式可用Cn(H2O)n表示第5頁/共80頁（一）、糖的分類

按照組成糖類的糖基個數：單糖：單糖是構成各種糖分子的基本單位。

低聚糖：(寡糖),由2-9個單糖分子聚合而成。多聚糖：由10個以上單糖分子聚合而成，通常由幾百甚至幾千個單糖分子組成。第6頁/共80頁單糖：多呈結晶狀態、有甜味，易溶于水，可溶于稀醇，難溶于高濃度乙醇，不溶于乙醚、氯仿等低極性溶劑，具有旋光和還原性。單糖在自然界中很少以游離狀態存在，在營養學上比較重要的有戊糖（五碳糖）和己糖（六碳糖）。己糖中最有營養意義的是葡萄糖、果糖和半乳糖。第7頁/共80頁第8頁/共80頁低聚糖：結晶性、有甜味，易溶于水，難溶于極性有機溶劑，易被酶或酸水解成單糖而具有旋光性；當分子中有游離醛基和酮基具有還原性，沒有則不具有還原性。低聚糖目前發現的為2-5個單糖分子的低聚糖，分別稱為雙糖（蔗糖、麥芽糖）和三糖（甘露三糖、龍膽三糖）等，在植物體內分布最廣的蔗糖。第9頁/共80頁蔗糖(sucrose)：由一分子葡萄糖和一分子果糖通過糖苷鍵連接而成，無還原性。

乳糖(lactose)：半乳糖和葡萄糖結合而成。存在與哺乳動物的乳汁中。

麥芽糖(maltose)：兩分子葡萄糖由糖苷鍵連接，具有還原性。第10頁/共80頁多糖的分類：均一多糖：由一種單糖組成的多糖；

淀粉—植物細胞（谷粒，塊根，果實）

糖原—動物細胞（如肝細胞中的糖原）

纖維素—植物細胞（木材50%，棉花90%）非均一多糖：由二種以上單糖組成的多糖；透明質酸，軟骨素第11頁/共80頁多糖的性質：多糖大多為無定形化合物，相對分子質量較大，無甜味和還原性，難溶于水，在水中的溶解度隨分子量增大而降低多糖被酶或酸水解為單糖，具有旋光性和還原性第12頁/共80頁（二）、多糖類藥物的功能：1.調節免疫功能主要表現為影響補體活性，促進淋巴細胞增生激活或提高吞噬細胞的功能，增強機體的抗炎、抗氧化和抗衰老的能力。第13頁/共80頁（二）、多糖類藥物的功能：2.抗感染作用可提高機體組織細胞對細菌、原蟲、病毒和真菌干擾的抵抗能力。

如：甲殼素對皮膚傷口有促進愈合作用3.促進細胞增殖和生長

通過促進細胞DNA、蛋白質合成，可促進細胞增殖和生長。第14頁/共80頁多糖類藥物的功能：4.抗輻射損傷作用

茯苓多糖、紫菜多糖等有抗Co-γ射線損傷的作用5.抗凝血作用（肝素，天然凝血劑）6.降血脂、抗動脈粥樣硬化作用。小分子肝素等具有降血脂、降膽固醇作用7.其他作用第15頁/共80頁真菌多糖的主要生物活性和功能：1.激活巨噬細胞巨噬細胞在抵御各種干擾和抗腫瘤方面具有主要作用，因而激活巨噬細胞可提高機體抗病能力。如：香菇多糖、靈芝、銀耳、黑木耳、冬蟲夏草等真菌中分離提取的多糖第16頁/共80頁真菌多糖的主要生物活性和功能：2.激活淋巴細胞癌癥和艾滋病患者由于化療和放療使體內免疫系統遭到嚴重破壞，而多糖化合物可部分恢復并加強患者的免疫功能。如：靈芝、銀耳、蜜環菌、冬蟲夏草等真菌中提取的多糖都能在體外顯著增強ConA誘導的淋巴細胞增殖第17頁/共80頁真菌多糖的主要生物活性和功能：3.促進干擾素（IFN）的生成

香菇多糖體內給藥12小時后，能促進血漿中的IFN的濃度達到高峰如：香菇多糖、靈芝、黑木耳、冬蟲夏草等真菌中分離提取的多糖第18頁/共80頁真菌多糖的主要生物活性和功能：4.誘生腫瘤壞死因子5.促進白細胞介素生成6.激活網狀內皮系統因此，在臨床上具有抗腫瘤，抗衰老，降血壓，血脂、血糖，健胃保肝作用。

第19頁/共80頁香菇多糖注射液

【性狀】本品為無色澄明的液體。

【適應癥】免疫調節劑，用于惡性腫瘤的輔助治療。第20頁/共80頁靈芝多糖膠囊【適宜人群】體虛人群輔助治療和大眾人群防病保健，增強體質。

第21頁/共80頁第二節糖類提取工藝特點一、糖類的溶解性與性質鑒定1.糖類的溶解性根據要提取的糖類的性質及原料中其他組分的特性，要從生物中直接提取糖類宜用水或稀醇。根據在水和乙醇中的溶解度不同，可分為六類

第22頁/共80頁第二節糖類提取工藝特點根據在水和乙醇中的溶解度不同，可分為：易溶于冷水和溫乙醇：

包括各種單糖、雙糖、三糖和多元醇類。易溶于冷水，不溶于乙醇：

果膠和樹膠類物質，常以鈣鎂鹽形式存在易溶于溫水、難溶于冷水、不溶于乙醇：

包括黏液質，如木聚糖、菊糖、糖淀粉等第23頁/共80頁根據在水和乙醇中的溶解度不同，可分為：難溶于冷水、熱水，可溶于稀堿：包括水不溶膠類，總稱半纖維素，如甘露聚糖等不溶于水和乙醇、部分溶于堿液：包括氧化纖維素類，可溶于氫氧化銅的氨溶液在以上溶劑中均不溶：如纖維素等第24頁/共80頁2.糖類的性質鑒定a.苯酚-硫酸法(棕色環試驗法）：試劑可與游離或多糖中的戊糖、己糖中的醛酸起顯色反應。測試：在樣品溶液中加入苯酚，搖勻，再沿壁滴加濃硫酸，發現有棕色環出現，表明含有糖類化合物。b.蒽酮-硫酸法：糖類化合物與硫酸發生脫水稱糠醛及其衍生物，然后與蒽酮縮合變成綠色物質。第25頁/共80頁2.糖類的性質鑒定c.費林試劑反應：具有還原性的糖可用將銅試劑還原稱氧化亞銅紅棕色沉淀而多糖無還原性，但在無機酸條件下，水解成具有還原性的單糖；可由此反應判斷單糖還是多糖d.成脎反應：成糖脎是多糖的特征反應第26頁/共80頁天然多糖主要是從植物或農副產品中提取分離而得到的常用方法：熱水浸提法酸堿浸提法酶法等二、糖類提取方法第27頁/共80頁水作為溶劑浸取多糖，溫度一般控制在50-90℃，恒溫水浴回流浸提2-4h；過濾得濾液和濾渣；濾渣再用水在相同條件下反復浸取3-5次；合并濾液，將其在恒溫水浴上濃縮揮發除去絕大多數水；然后邊攪拌邊加入適當的2-5倍體積的乙醇，多糖呈絮狀沉淀析出，離心分離，用適量丙酮或乙醚洗滌脫水；再真空干燥或直接冷凍干燥即得粗多糖。1.熱水浸提法第28頁/共80頁優點：操作簡單缺點：水為溶劑浸提，難以完全溶出其中的多糖物質，需反復多次浸提，操作時間長，收率低注意：易溶于水的多糖，注意溫度是否破壞結構。如：水溶性的螺旋藻多糖不宜用熱水浸提1.熱水浸提法第29頁/共80頁2.酸浸提法該法的浸提是在酸性條件下完成，操作如下：向原料中加鹽酸溶液，使其最終濃度為0.3mol/L，然后置于90℃恒溫水浴中浸提1-4h，用堿中和后過濾，濾渣加鹽酸反復浸提2-3次，最后合并濾液；濃縮，用95%乙醇沉淀、分離、洗滌脫水、干燥得粗多糖。第30頁/共80頁3.堿浸提法向原料中加NaOH溶液，使其最終濃度為0.5mol/L，然后置于90℃恒溫水浴中浸提1-4h，用酸中和后過濾，濾渣加堿反復浸提2-3次，最后合并濾液；濃縮，用95%乙醇沉淀、分離、洗滌脫水、干燥得粗多糖。第31頁/共80頁注意：酸堿浸提由于酸堿濃度因子難以控制易使部分多糖發生水解，破壞多糖的活性結構，減少多糖得率。第32頁/共80頁4.酶法該法先用蛋白酶分解除去大部分蛋白質，再從溶液中浸提多糖可以使濃縮工藝和后續的脫蛋白工藝操作變得簡易、省時，提高粗多糖的得率。第33頁/共80頁5.超聲波提取法：利用超聲波對細胞組織的破碎作用來提高糖類在提取液中的溶解度和浸出率，從而可提高多糖的提取率。操作時，先將原料放入浸提液中，經超聲波處理一段時間后，過濾，即得糖類提取液。第34頁/共80頁6.超臨界萃取法：利用CO2等氣體在超臨界的條件下呈現出特殊的液相特征，來提取原料中的糖類物質。這種方法對物質活性的保存率很高，但成本較高，目前大多用于價值較高的成分的提取。第35頁/共80頁7.影響糖類提取的因素主要因素是原料提取工藝條件分離工藝等

第36頁/共80頁7.影響糖類提取的因素原料：品種不同，多糖含量不同；一般選擇含量較高的原料品種提取工藝條件：應根據具體生產環境和設備條件，通過試驗確定其最佳工藝條件；第37頁/共80頁浸提料液比：料液比的上升會增加多糖的溶出量，到達一定的比例后，上升幅度明顯下降，且會對后續工藝造成不良影響，降低生產效率。溫度對靈芝多糖提取有顯著影響，溫度上升提取率顯著上升，一般80-100度理想。浸提時間：隨著熱提時間增加，多糖提取率增加，但增加趨勢趨緩，時間過長，提取率有下降趨勢；且受熱時間過長，多糖的糖苷鍵會斷裂導致多糖含量降低第38頁/共80頁7.影響糖類提取的因素分離工藝的影響采用水提醇沉工藝時，有機溶劑的濃度、加入量等因素會對提取率造成一定的影響。采用膜分離工藝時，膜材料、分離順序、壓力等因素都會對提取率產生直接影響。第39頁/共80頁三、糖類的分離1.水提醇沉法

常用的多糖提取工藝。是利用多糖溶于水或酸、堿、鹽溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有機溶劑的特點，從不同材料中進行提取。提取時一般先將原料物質脫脂與脫游離色素，然后用水或稀酸、堿、鹽溶液提取，提取液濃縮后即以等重或數倍的甲醇、乙醇、或丙酮等沉淀析出，得粗多糖。第40頁/共80頁三、糖類的分離1.水提醇沉法

常用的多糖提取工藝優點：水對設備要求不高，一次性投入較小；缺點：勞動強度大，工藝繁雜，不能連續生產，生長效率低，所獲產品活性損失大；且生產中產生的廢料造成污染。第41頁/共80頁2.膜分離法與透析法膜分離是利用多糖相對分子量大小，在通過半透膜時，實現機械分離。然后再低溫濃縮、干燥得粗多糖。優點：采用低溫工藝，對多糖體活性保存較好，能耗低，速度快，費用省，在生長過程中不產生污染；缺點：對設備要求高，管理水平要求也高。第42頁/共80頁2.膜分離法與透析法透析法是利用一定大小孔目的膜，使無機鹽或小分子糖透過而達到分離目的的方法。注意：選擇合適的膜非常重要。纖維膜孔小于2-3nm，適用于糖類，可使單糖分子通過；孔目稍大的3-5nm，小分子透過加速，多糖留在不透析部分。透析在逆相流水中進行或需經常換水，pH保持在6.0-6.5，時間可達數天，透析液濃縮后可用乙醇沉淀多糖第43頁/共80頁3.分級沉淀法利用隨著聚合度的增大，糖類在醇中的溶解度逐步降低的性質。在糖的高濃度水溶液中，分次加入乙醇，使醇濃度逐步增加50、100、150/L等,分別取出在每個醇濃度析出的沉淀，作圖，粗略確定適宜糖類大量析出的醇濃度。注意：采用此法時，一般應將提取液的pH調至7.0左右；酸性多糖調至2-4。缺點：此法只適合糖類的粗略分離，要獲得均一組分，需反復使用同一種方法或綜合使用多種方法。第44頁/共80頁4.活性炭柱層析法此法適合于分離低聚糖的混合物。通常用活性炭和硅藻土的等量混合物柱層析法進行糖液分離。在此，硅藻土有利于層析時洗脫液的通過也可用40-60目的顆粒狀活性炭裝柱第45頁/共80頁5.凝膠過濾法主要是利用具有三維網狀的多孔性凝膠來進行糖類的分離（凝膠孔徑的大小取決于形成凝膠時的交聯程度）。當含有待分離的物質溶液流經凝膠柱時，小分子成分易擴散進入空中，而大的不易進入孔中；洗脫時，分子量從大到小一次流出。特別適用于分離具有不同聚合度的糖。且快速、簡單、條件溫和。第46頁/共80頁6.離子交換樹脂層析法陰離子交換樹脂AmberlitIR-400，用NaOH處理過后，可用選擇性地吸附還原糖，完全不吸附糖醇和苷，而部分吸附蔗糖。所有的糖都可用100g/LNaCl溶液洗脫出。陽離子交換樹脂可用于酸性糖類和中性糖類的分離。中性糖類的多羥基結構與硼酸絡合酸性酯后，也可用離子交換樹脂進行分離。強堿性陰離子交換樹脂Dowex-1對分離雙糖有不同的吸附力，可以分離蔗糖、麥芽糖和乳糖等；此方法效率高，但洗脫體積大，后處理麻煩。第47頁/共80頁7.季銨鹽沉淀法陽離子型清潔劑，如十六烷基三甲銨鹽（CTA鹽）和十六烷基吡啶鹽（CP鹽）等和酸性多糖陰離子可用形成不溶于水的沉淀，從而使酸性多糖從水溶液中沉淀出，而中性留存在母液中。再利用硼酸絡合物，使中性多糖沉淀下來。通過將十六烷基三甲銨溴化物(CTAB)順次加入不同pH的多糖水溶液中，就可在酸性、中性、微堿性、強堿性的溶液中分布沉淀出，達到分離目的。第48頁/共80頁7.季銨鹽沉淀法根據沉淀物的性質，分為三種：沉淀溶于無機鹽溶液：將沉淀物加入4mol/L的NaCl或KCl溶液中，如溶解，則表示該多糖已轉化為鈉鹽或鉀鹽，可直接加入3-5倍乙醇使多糖沉淀下來，季銨氯化物就會留在上清夜中；成鈉鹽的糖可用鹽酸處理，使其恢復為游離糖；最后再以透析或冷凍干燥法獲得多糖第49頁/共80頁7.季銨鹽沉淀法沉淀溶于有機溶劑：使沉淀溶于乙醇或丙酮，在溶液中加NaCl，NaAc等無機鹽。添加時，先將無機鹽溶于乙醇或制成很濃的水溶液。加入鹽后，多糖以鈉鹽沉淀下來，再加鹽酸，恢復游離多糖。鹽水和有機溶液均不溶：沉淀加入無機鹽的醇飽和溶液中，多糖在沉淀里，用醇洗去無機鹽后，加酸恢復多糖。第50頁/共80頁8.金屬離子沉淀法銅鹽沉淀法可用CuCl2，CuSO4，Fehling試劑、乙二胺銅試劑。常用的方法為Fehling試劑和醋酸銅乙醇法第51頁/共80頁8.金屬離子沉淀法醋酸銅乙醇法：在多糖水或NaOH溶液中添加70g/LCu(Ac)2溶液直至沉淀多糖完全。離心分取沉淀后，離心液加Cu(Ac)2溶液和足量乙醇，得第二次沉淀。反復分級獲得各種多糖的銅復合物，再分別用50ml/LHCl的乙醇溶液分解游離多糖。第52頁/共80頁8.金屬離子沉淀法氫氧化鋇沉淀法飽和的Ba(OH)2溶液可使樹膠類多糖沉淀，特別容易使D-甘露聚糖沉淀下來，從而與木聚糖分離開來。葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和其他甘露聚糖在氫氧化鋇濃度低于0.03mol/L時幾乎可用沉淀完全。而阿聚糖、半乳聚糖在任何濃度的Ba(OH)2溶液中均不沉淀。第53頁/共80頁9.糖類提取液除蛋白質和脫色原料中大量的蛋白質，除去它是一個重要的環節常用的方法：Sevage法三氟三氯乙烷法三氯乙酸法(TLA)第54頁/共80頁Sevage法：用氯仿：戊醇5:1或4:1的二元溶劑體系與粗多糖混合，劇烈振搖20-30min，蛋白質變性形成膠狀，離心后處于氯仿和水二層中間，從而得以除去。加速蛋白質的變性，可用pH4-5的緩沖液代替水，并加入少量的正丁醇或正戊醇。缺點：重復多次才可除盡蛋白質，損失較大改進：可用酶法除去大部分蛋白質，再用此法除去剩余蛋白質。第55頁/共80頁三氯乙烷法：按多糖溶液：三氯乙烷1:1的比例配成溶液加入，在低溫下攪拌約10min，離心得上層水層，水層繼續同法處理幾次即得。優點：效率高。缺點：溶劑沸點較低，易揮發，不宜大量應用。第56頁/共80頁三氯乙酸法（TLA）：在多糖溶液中滴加30g/L三氯乙酸，直至溶液不再繼續渾濁為止，在5-10℃放置過夜，離心除去沉淀即得無蛋白的多糖溶液。缺點：會引起某些多糖的降解。第57頁/共80頁四、多糖的純度檢驗和結構分析單糖組分的分析：氣相色譜GC、液相色譜HPLC，毛細管電泳法常用于單糖組分的分析。糖苷鍵類型及連接方式：甲基化、高碘酸氧化和smith降解、乙酰解、核磁共振、質譜等分析方法。多糖高級結構：采用物理方法，如：X射線，纖維衍射法，電鏡法等。第58頁/共80頁1.產品的純度檢查采用玻璃纖維紙電泳對其進行純度檢查：用聚丙烯酰胺凝膠電泳純度檢查法檢查采用HPLC法檢測：第59頁/共80頁2.多糖的結構分析分析手段有物理方法和化學方法：物理方法常用的有：1.GC和GC-MS聯用：用于測出多糖的組成，及各單糖之間的摩爾比，此法要求樣品具有一定的揮發性，待測樣品多需制備成硅烷衍生物和乙酰化衍生物等第60頁/共80頁2.核磁共振光譜（NMR）法：用于確定多糖結構半糖苷鍵的構型以及重復結構中單糖的數目。一般用1HNMR測定簡單多糖，

13CNMR測定復雜的多糖。3.紫外光譜法：在260-280nm處用于檢測多糖中是否含有蛋白質、核酸、多肽類。第61頁/共80頁4.紅外光譜法：用于確定吡喃糖的糖苷鍵構型及其他官能團。一般多糖類物質的特征吸收峰為：3440cm-1處為-OH的吸收振動峰；2935cm-1處為C－H的伸縮振動吸收峰；1510－1670cm-1之間的吸收峰為C=O的振動峰;1410cm-1處為C－H的彎曲振動吸收峰；1090cm-1處為吡喃環結構的C－O的吸收峰等。第62頁/共80頁2.多糖的結構分析化學方法常用的有：酸水解：完全水解和部分水解法

用于鑒定多糖中單糖組分或多糖中的低聚糖。其他的還有甲基化反應、堿降解等方法。第63頁/共80頁第三節糖類提取實例單糖的提取（D-甘露醇的提取）D－甘露醇的作用：

降低顱內壓，使由腦水腫引起休克的病人神志清醒；用于大面積燒傷及燙傷產生的水腫；有利尿作用，用以防治腎臟衰竭；降低眼內壓、治療急性青光眼；還用于中毒性肺炎，循環虛脫癥等。在海藻、海帶中的含量較高，是提取甘露醇的重要來源。第64頁/共80頁甘露醇注射液

MannitolInjection本品主要成分及其化學名稱:D-甘露糖醇。

【性狀】本品為無色的澄明液體。【適應癥】

（1）組織脫水藥。用于治療各種原因引起的腦水腫，降低顱內壓，防止腦疝。（2）降低眼內壓。可有效降低眼內壓，應用于其他降眼內壓藥無效時或眼內手術前準備。（3）滲透性利尿藥。用于鑒別腎前性因素或急性腎功能衰竭引起的少尿。亦可應用于預防各種原因引起的急性腎小管壞死。（4）作為輔助性利尿措施治療腎病綜合征、肝硬化腹水，尤其是當伴有低蛋白血癥時。（5）對某些藥物逾量或毒物中毒（如巴比妥類藥物、鋰、水楊酸鹽和溴化物等），本藥可促進上述物質的排泄，并防止腎毒性。（6）作為沖洗劑，應用于經尿道內作前列腺切除術。（7）術前腸道準備。第65頁/共80頁(1)工藝流程海藻或海帶浸泡提取自來水浸泡液凝集黏性物pH10-11,8h上清液中和pH6-7中性提取物濃縮110－115℃濃縮物乙醇沉淀95%乙醇沉淀物乙醇回流除雜質精制水，活性炭干燥105-110℃粗品甘露醇結晶甘露醇藥用甘露醇第66頁/共80頁（2）工藝過程及控制要點浸泡提取、堿化、中和：加20倍量水，室溫下浸泡2-3h，浸泡液套用作第二批原料的提取溶劑，一般套用4批，浸泡液中的甘露醇含量已較大。去浸泡液用300g/LNaOH，調pH為10-11，靜置8h，凝聚沉淀多糖類黏性物。虹吸上清液，用500ml/LH2SO4中和至pH6-7，進一步除去膠狀物，得中性提取物。第67頁/共80頁（2）工藝過程及控制要點濃縮、沉淀：沸騰濃縮中性提取液，除去膠狀物，直到濃縮液含甘露醇300g/L以上，冷卻至60-70℃趁熱加入2倍量950ml/L乙醇，攪拌均勻，冷卻至室溫，離心收集灰白色松散沉淀物。第68頁/共80頁（2）工藝過程及控制要點精制：取含量大于900g/kg的樣品溶于適量蒸餾水中，加入活性炭，80℃保溫0.5h，濾清清液冷卻室溫，結晶、抽濾、洗滌得精品甘露醇。干燥：105－110℃烘干。包裝：無菌包裝。第69頁/共80頁大豆低聚糖（soybeanoligosaccharides):

大豆中可溶性寡糖的總稱，主要成分是蔗糖、綿子糖、水蘇糖及少量的毛蕊花糖。大豆低聚糖的作用：

促進雙歧桿菌的增殖，減少有毒發酵產物及有害細菌酶的產生，已知病原菌和腹瀉，防止便秘，保護肝臟，降低血清膽固醇，佳果的血壓，增強免疫力，抗腫瘤，低能量或無能量，對人體安全等特性。低聚糖的提取（大豆低聚糖的提取）第70頁/共80頁（1）提取工藝流程大豆乳清除蛋白取上清液，進行超濾脫色濃縮離心除去殘余的蛋白脫鹽產品大豆蛋白的去除：工業上是