外源基因表達第1頁/共11頁第七章外源基因表達一、表達機制1．起始轉錄：轉錄起始的速率是gene表達的限速步驟，用誘導型啟動子（Lac、Trp、PL/PR、tac、組成型啟動子：T7）2．MRNA延伸與穩定：正常終止序列、減少DNA反向轉錄產生反義mRNA、polyA摻入對3’正確加工3．MRNA有效翻譯：AUG首選起始codon、SD序列與16srRNA互補結合，含有至少AGGAGG中4個堿基、SD與ATG間距離3-9bp、翻譯起始區周圍不形成明顯二級結構、codon選擇性相近（沒有明顯偏好性不同）4．Pr穩定性：構建融合pr、分泌pr、包涵體pr、pr水解酶缺陷型受體細胞第2頁/共11頁第七章基因表達系統外源基因表達系統泛指目的基因與表達載體重組后，導入合適受體細胞，并在其中有效表達，產生目的基因產物1．E.coli表達系統：常用lac&tac：以lac操縱子調控機制為基礎：lacPlacO結構基因（lacZ,Y,A），lacI阻遏pr，IPTG誘導，PL&PR：以phage溶原/溶菌循環T7啟動子：T7RNA聚合酶識別序列在pET中MCS上端，RNA聚合酶位于BL21(DE3)基因組中，上端為lac啟動子調控，IPTG第3頁/共11頁第七章基因表達系統外源pr表達形式：包涵體pr：融合pr：寡聚型pr：多表達單元重組、多順反子、多編碼序列第4頁/共11頁第七章高效表達策略優化表達載體設計：啟動子和mRNA中SD序列優化，強啟動子，SD—ATG間距，RBS莖環結構稀有codontRNA，外源mRNA穩定性、外源pr穩定性：pr分泌胞外，prE缺失，prE敏感序列修飾，pr穩定性因子優化發酵過程：工藝生物學：菌體生長，表達條件，產物總量第5頁/共11頁TheexpressionvectorMostimportantelementsinthevectorPromoter-35:TTGACA(E.coli)-10:TATAAT(E.coli)Terminator(hairpin)Ribosomebindingsite(RBS)SelectionmarkerVectorreplicationsequence(ori)Polylinker(MCS)Inthegene/vectorStart(ATG)Stop(1-2TAA,(TAG,TGA))Signalpeptide第6頁/共11頁tacpromoterHybridpromoterfusionfromlacandtrppromoters+ CombinesstrongRNApolymerasebindingsequences+ 5xstrongerthanlacpromoter+ 20-30%oftotalprotein+ InducedbyIPTG第7頁/共11頁lPLpromoterIsolatedfromlbacteriophage-repressor(cI)bindstolPLpromoter+/- cI857variantheatinducible>30degrees,expression+/- Alternativelyusespecialstrainswithrepressorunder controloftrppromoterwhichisinducedbyTrpaddition+ Tightlyregulated-goodfortoxicproteinsTargetproteinTargetgenelPLRepressorgenecIrepressortrppromoterTrp++第8頁/共11頁T7system(pET-system)T7RNApolymerasegenecontrolledbylacpromoterIPTGinducesT7RNApolymeraseproductionT7RNApolymerasetranscribesgenecontrolledbyT7promoterTargetgenecannotbeactivatedbyhostRNApolymeraseSpecialstrainneededlacOinpETandpLysSreducesleakiness第9頁/共11頁GALsystemGeneclonedundercontroloftheGAL4promoterInductionbygalactoseasthesolecarbonsourceStrongerinductio